重组H9N2亚型禽流感病毒的构建及其在A549细胞上适应性研究

贾佳

（广西医科大学第一附属医院 广西南宁 530021）

重组H9N2亚型禽流感病毒的构建及其在A549细胞上适应性研究

贾佳

（广西医科大学第一附属医院 广西南宁 530021）

目的： 利用反向遗传技术构建表达GFP并具有感染性的重组H9N2亚型禽流感病毒，并用高剂量和低剂量MOI病毒感染肿瘤细胞A549，研究其对A549肿瘤细胞的作用。方法： 以A/Chicken/Jiangsu/14（H9N2）禽流感病毒为骨架，在NS1和NEP之间插入外源片段GFP。参考8质粒转染系统，在293T和MDCK细胞上包装产生重组H9N2病毒。提取尿囊液RNA，PCR鉴定并测序，检测其TCID50。按照MOI 0.1和2.0分别将重组病毒感染不同的细胞，通过MTT实验检测细胞活性。结果： 应用反向遗传技术成功获得了重组病毒，并且发现病毒可以诱导A549的凋亡。结论：成功构建了表达GFP的重组病毒，并且其可以诱导A549的凋亡。

H9N2禽流感病毒 反向遗传技术 A549

随着反向遗传技术的不断完善，对流感病毒的改造和利用成为可能［1］。流感具有强传染性，将其改造成携带外源基因的流感病毒载体，有利于转染到目的细胞，特别是肿瘤细胞，为肿瘤基因治疗提供新的手段［2，3］本文利用H9N2亚型禽流感病毒为骨架，参考H9N2的反向遗传质粒构建方案［4］，构建表达绿色荧光蛋白GFP，更方便的观察重组病毒在细胞内的复制情况。研究了重组病毒在A549细胞上的生长情况。

1 材料和方法

1.1 毒株、质粒和细胞

H9N2流感病毒的8个基因片段的载体质粒以及PHW2000表达/转录载体质粒是由扬州大学传染病重点实验室构建并保存。PEGFP-C1质粒购于BD Biosciences 公司。293T和MDCK细胞用含1 0%胎牛血清的D ME M培养。

1.2 主要试剂

Platinum TaqDNA Polymerase High Fidelity 是Ivitrogen产品。BsmBI是BioLabs产品。PolyFect Transfection Reagent转染试剂购于Qiagen公司。质粒DNA小量提取试剂盒是Axygen产品，10mL/L鸡红细胞按常规方法自行制备。

1.3 病毒转录/表达载体的构建参考Manissamy、 Hoffmann报道［5，6］以 DNAstar 软件设计扩增NS1、NEP、PEGFP-C1基因的特异性引物。引物是由南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司合成（PAGE纯化）。以PHW2000-NS、PEGFP-C1为模板，PCR扩增N S 1、N E P、G F P的目的片段，并用B s m B I酶切目的片段和PHW2000，电泳、回收后，在T4连接酶作用下连接，转化、挑取单个菌落后扩大培养，小提质粒，送南京金斯瑞公司测序。测序结果比对正确的质粒扩大培养后，无菌提取用于转染。

1.4 病毒拯救

将293T细胞和MDCK细胞按照2：1的细胞量铺入6孔板中，待细胞丰度达70-90%时用无抗无血的DMEM洗2次进行转染。转染方法参照PolyFectR Transfection Reagent的使用说明书。

1.5 重组病毒的鉴定

收集转染细胞和上清，接种于9-10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，每个样品接种3个胚，37℃孵化箱培养96h，收集尿囊液进行鉴定：

1）拯救病毒的血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验：均按照OIE操作标准进行。拯救病毒的尿囊液用1%鸡红细胞进行HA试验，HA阳性者用H9、H5和形成以（NDV）阳性血清进行HI试验。

2）重组病毒的基因保真性鉴定：取HA和HI阳性尿囊液提取RNA，用RT-PCR法对各个拯救病毒进行扩增、测序和验证。

3）病毒的繁殖能力测定：测定鸡胚半数感染量（EID50）将拯救病毒的尿囊液用灭菌的PBS进行10倍连续稀释，每个稀释度接种5枚SPF鸡胚，每胚0.2ML，用Reed-Muench法计算。

1.6 重组病毒在A549细胞上的复制情况

按照MOI为0.1和2.0 PFU/cell两个剂量分别感染1X106cell/ mL 的A549细胞，37℃吸附1h后，弃去培养基，用10%DMEM补上。48h后在倒置显微镜下观察细胞病变情况（CPE）。

1.7 细胞活力分析

按照MOI为0.1和2.0 PFU/cell两个剂量分别感染1X106cell/ mL 的A549细胞，48h内每隔8h收集一次上清，用MTT实验检测细胞的活力。即A549（5000/孔）铺于96孔板，加入上述上清，PBS洗后加入DMEM培养基和50u/孔的MTT，37℃孵育3h。弃液，每孔加200ul异丙醇，室温1h后，用ELASA读数仪测量在540nm下的OD值。

2 结果与分析

2.1 重组病毒拯救与鉴定

1）病毒拯救：按8质粒转染系统，将构建的8质粒共转染293T与MDCK混合细胞，获得重组病毒。HA试验表明拯救病毒尿囊液效价为28。用H9、H5亚型禽流感病毒血清阳性血清对其进行HI试验，结果仅H9阳性血清呈阳性，效价为25。

2）拯救病毒的保真性鉴定：将拯救的重组病毒尿囊液提取RNA，进行RT-PCR扩增各片段并测序，测序结果显示序列结果一致，NS-GFP已成功构建。

3）获救病毒鸡胚半数致死剂量（EID50）的测定：参照文献方法，H9N2亚型流感病毒鸡胚半数感染量（EID50）为10-7/0.2mL。

2.2 重组病毒感染A549后细胞的生长情况

A549在高剂量感染后从16h开始逐渐增长，在24h达到半数感染量，开始出现细胞变小变形。细胞在低剂量病毒感染下没有改变。MTT分析显示A549细胞在MOI 0.1时细胞死亡明显。

3 讨论

溶瘤病毒 （Oncolytic virus ，OV） 是天然或经人工改造的能特异性在肿瘤细胞内大量复制并最终破坏肿瘤细胞，而对正常组织细胞无杀伤作用的一类病毒［7］。流感病毒作为一种新型的溶瘤病毒正在进行深入研究中。目前研究发现其对肿瘤细胞具有一定的诱导凋亡的作用［8］，如禽流感病毒的NS1蛋白可以通过PKR介导的干扰素途径诱导细胞凋亡，且具有一定的靶向性［9］。随着反向遗传技术的发展和病毒学的完善，利用基因改造等方法以流感病毒作为载体，携带外源基因，增强抗肿瘤免疫反应成为一项新的热点［10］。本文选择低致病性的H 9N 2亚型禽流感病毒，通过反向遗传技术构建表达GFP的重组病毒，直接通过观察荧光强度更方便的应用于观察禽流感病毒在肿瘤细胞上的复制情况和肿瘤细胞的死亡情况，为进一步研究流感病毒携带外源基因用于抗肿瘤研究提供了新思路。

［1］Neumann G， Kawaoka Y： Reverse genetics of influenza virus. Virology 2001， 287（2）：243-250.

［2］李颖婷， 谢剑锋， 郑奎城： 流感病毒反向遗传技术的研究进展.海峡预防医学杂志 2015.

［3］陈帅帅， 沃恩康， 王怡婷， 郭潮潭： 流感病毒介导的抗肿瘤研究进展. 医学研究杂志 2014， 第8期：4-6.

［4］Jing B， Chen-Jun LI， Chen HL： Rescue of H9N2 subtype influenza virus by reverse genetics system. Chinese Journal of Veterinary Science 2011.

［5］Hoffmann E， Krauss S， Perez D， Webby R， Webster RG： Eightplasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine 2002， 20（25-26）：3165-3170.

［6］Manicassamy B， Manicassamy S， Belicha-Villanueva A， Pisanelli G， Pulendran B， Garcia-Sastre A： Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010， 107（25）：11531-11536.

［7］Russell SJ， Peng KW， Bell JC： Oncolytic virotherapy. Nature biotechnology 2012， 30（7）.

［8］Schultz-Cherry S， Dybdahl-Sissoko N， Neumann G， Kawaoka Y，Hinshaw VS： Influenza Virus NS1 Protein Induces Apoptosis in Cultured Cells. Journal of virology 2001， 75（17）：7875-7881.

［9］Engel DA： The influenza virus NS1 protein as a therapeutic target. Antiviral research 2013， 99（3）：409-416.

［10］Murphy A， Westwood JA， Brown LE， Teng MW， Moeller M， Xu Y，Smyth MJ， Hwu P， Darcy PK， Kershaw MH： Antitumor activity of dual-specific T cells and influenza virus. Cancer gene therapy 2007， 14（5）：499-508.

Q2

A

1674-2060（2016）02-0015-02