黄孢原毛平革菌降解土霉素的影响因素及酶活分析

王慧琴 赵敏

（郑州澍青医学高等专科学校 河南郑州 450064）

黄孢原毛平革菌降解土霉素的影响因素及酶活分析

王慧琴 赵敏

（郑州澍青医学高等专科学校 河南郑州 450064）

目的：黄孢原毛平革菌降解土霉素的影响因素及酶活分析。方法：文章使用的方法有制备实验菌种和孢子悬浮液、测定校准曲线及样品与测定酶活性等。结果：培养基中的营养物质真菌降解抗生素和吸附重金属特性减少然后，产生了酶的次生阶段，不利于营养的获得，分泌了锰过氧化物酶，酶活不断增加，达到了最大值。活跃期过后，酶活逐渐降低，在培养后期，产生的代谢物越来越多，堆集了大量的有毒代谢物，降低了锰过氧化物酶活性。讨论：当土壤浓度维持在200mg/L时，采用固化或者是非固化的方式后，黄孢原毛平革菌对土壤的降解度分别为92.44%与67.63%。在实验过程中，使用了两种方式处理，但菌产锰过氧化物酶酶培养96h之后，土霉素达到了最大浓度，为70 mg/L，相应为 527.40 U/L与73.90 U/L；使用两种处理方式，菌产木质素过氧化物酶都要先培养96h之后，土霉素浓度变成了70 mg/L，这个时候是最大值，相应为 0.384 U/L与O.204 U/L，因此，黄孢原毛平革菌降解土霉素时，起到关键作用的是锰过氧化物酶。文章可行性研究了黄孢原毛平革菌降解土霉素。实验相应地考察了p H值、土霉素初始浓度是如何影响影响黄孢原毛平革菌降解土霉素。实验结果显示，相应地增加土霉素的浓度，能提升酶活，当超过一定限度时，酶的活性会随着增加而降低。

黄毛原毛平原革菌 讲解 土霉素 酶活

随着现代工业在发展，许多重金属进入到生态系统中，同时人与动物在治疗过程中还向生态环境中投放了大量抗生素。重金属与抗生素具有连续性与积累性的特征，对环境带来永久性污染，对空气、水等造成了严重破坏。生物处理技术花费成本低，具有可靠的操作工艺，污染较少，受到人们的普遍关注。黄孢原毛平革菌具有氧化特性和对木质素降解没有底物特异性［1］。黄孢原毛平革菌具有独特的吸附与分解能力，被认为是一种有效的生物修复剂。文章在具体研究时，在固化于分固化的条件下，分析了不同浓度对黄孢原毛平革菌的影响。采用固定方法，处理黄孢原毛平革菌后，显著提升了降解效果与酶的活性。

1 实验材料与方法

1.1 主要实验仪器

（1）电子分析天平（BS224S，北京）；（2）高效液相色谱（LA.10A，日本））；（3）旋片式真空泵（2XZ.2，临海）；（4）电炉、石棉网、牛皮纸等，恒温水浴锅、培养皿等。

1.2 方法

1.2.1 制备实验菌种和孢子悬浮液

在4℃时，培养真菌培养物，放置到马铃薯葡萄糖琼脂培养基中。为了让菌种处于正常生理机能的状态，首先，要活化。因此，使用前，要将其放置在44"C下的平板上，转移到37℃培养箱中，然后，转到37℃培养箱中，接受24小时的活化。使用时，转移到PDA平板，在30。C病培养几天。包好将使用的、装有适量蒸馏水的Biolog管灭菌，冷却后，放置在浊度计上，调零，从平皿上，使用无菌棉签，粘取适量的目标菌孢，溶入，搅拌，让孢子在其中分散，生成孢子悬液。在该次实验中，把浊度调至60%时，每毫升孢子悬浮液数量级别为2.0×16个孢子。

（1）配制0.1mol/L盐酸溶液，选取8.33 ml特级纯盐酸，配置成0.1mol/L盐酸溶液1L。（2）形成了0.0509/L土霉素标准储备液，准确量取0.050 g土霉素（99.99%），兑入5m L、0.1mol/L盐酸溶液溶解，然后，转移到50 ml容量瓶中，同时兑入纯水，使体积保持在 50 ml，混合混匀，这时配置的溶液每毫升1.00 mg土霉素。（3）准确量取1.00mg/m L土霉素标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0与7.00m L，相应放入7个50 m L的容量瓶中，兑入盐酸溶液，确定好容积，摇匀，使配置的溶液浓度为 O.02 mg/m L、0.04 mg/m L、O.06 mg /m L、O.08mg/m L、0.10 mg/m L、0.12mg/m L、0.14 mg /m L的土霉素标准溶液。

1.2.2 测定校准曲线及样品

（1）确保仪器状态最佳，按照一定顺序，相测定标准系列溶液，降峰面积作为纵坐标，把浓度作为横坐标，绘制标准曲线。接着，把样品溶液进入液相测量，从标准曲线能获得样品溶液包含的土霉素浓度。（2）样品测定依照要求，取样后，稀释样品，确保浓度在l mg/L以下，经过0.45 gm滤膜过滤，使用有效液相色谱，检测滤液中包含的土霉素含量。

1.2.3 测定酶活性

酶是一种高分子物质，具有生物催化功能，所以，多用来催化某一反应能力，以此衡量酶活性。酶活性的大小，通常使用酶活力单位来表示。在本实验中，胞外过氧化物酶中酶活的测定主要使用紫外分光光度。这种方法具有如下优点：费用少，仪器设备与操作较为简单，具有较高的灵敏度，选择性好，使用范围广，分析速度快。在锰过氧化酶活性测量体系中，通常将Mn2+作为底物；在木质素过氧化物酶活性测量体系中，将藜芦醇作为底物；然后，添加H202置于两者中，产生启动反应。该实验间隔12小时，取样一次，用O.45 um滤膜过滤粗酶液，对过氧化物酶的活性，用紫外分光光度计测定。（1）原理：H202启动反应，藜芦醇（VA）在木质素过氧化物酶（Li P）催化下，被氧化为藜芦醛，因为藜芦醇不能在310nm波长处吸收，然而，藜芦醛在310 nm波长处吸收强。利用藜芦醛这种特点，连续紫外分光光度测定，将藜芦醇转变为藜芦醛，作为Li P活性的标志。（2）酶活测定配制 3 ml反应体系：粗酶液0.4m L；酒石0.1 mol/L，p H值3.0，酸缓冲液1.5m L；10mmol/L，藜芦醇1.0m L；10mmol/LH202，启动反应0.1m L。

1.2.4 降解实验

（1）无菌海藻酸钠溶液80m L 4%与孢子悬浮液40m L，浓度106个/m L，混合均匀，用注射器各自注射6m L，并将混合溶液滴入无菌80m L、 4%的Ca Cl2溶液中，生成了均匀的粒径3mm的小球，室温下静置4h。（2）配带t J4L的Kirk液体培养基。（3）用无菌超纯水，清洗3次固定化小球，转移到剩余的l 8瓶1 00m L培养基中，放置在35℃、120rpm下培养。用锡箔纸，包好上述锥形瓶，配制不同浓度土霉素溶液，每组实验组设三个平行，加入以上培养基中，在摇床上，恒温、避光、恒转速，降解一定时间，接着过滤，隔12h取样，对不同浓度的土霉素的降解效果和酶活性，分别测定固定化与未固定化的黄孢原毛平革菌带来的影响。滤液中剩余的土霉素含量，用高效液相色谱法测定酶活性，用紫外分光光度计测定。反复测每份样品三次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 影响土霉素降解效率

固定化的黄孢原毛平革菌对土霉素的降解率如下，土霉素的初始浓度相应为50、70、l 00、1 30、160、200mg/L。固定化的黄孢原毛平革菌对不同浓度的土霉素具有不同的降解效率，刚开始时，土霉素的降解效显然高于土霉素的降解效率，72h后，他们的降解速度取于平稳。

2.2 实验药品

酒石酸铵、土霉素标准品与海藻酸钙等，试剂全是分析纯。

2.3 培养基

本实验用Kirk液体培养基，培养基的基础溶液：微量元素液100 m L、葡萄糖10 g与酒石酸铵0.29等。

2.4 土霉素含量和酶活性的测定方法

本实验使用高效液相色谱法，对滤液中余下的土霉素含量进测定。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度。

2.5 色谱条件

检测波长254nm；进样量20p L；流量0.7m L/min；柱温为35℃；流动相为0.1%磷酸：甲醇（40：60）；理论塔板数按土霉素峰面积计算，不小于2500。

2.6 未固定化的黄孢原毛平革菌的锰过氧化物酶（Mn P）的活性变化

在加外源物培养前48h，酶活小，72 h后，酶活显著提升，主要原因在于在营养限制环境下，锰过氧化物酶的活性非常活跃，培养72天后，明显减少了培养基中的营养物质真菌降解抗生素和吸附重金属特性，这时的酶开始处在次生阶段，限制了营养，促使分泌了锰过氧化物酶，酶活最大。活跃期后，酶活开始降低。

2.7 木质素过氧化物酶（Li P）

从上述分析中得出，固定化培养中的黄孢原毛平革菌的生长代谢不会受到影响，同时还提高了代谢活动与Li P酶活性。在培养前72 h，酶活较低，第96 h后，酶活显著提高，主要因为木质素过氧化物酶在硫限制与碳等营养限制环境下相对活跃，培养72天后，培养基中的营养物质开始减少，酶处在次生阶段，分泌木质素过氧化物酶。活跃后，酶活开始降低，因为在培养后期，代谢产物堆集，形成了大量的有毒代谢，严重影响了木质素过氧化物酶活性。

3 讨论

土霉素和重金属浓度的增加，对于黄孢原毛平革菌的生长具有潜在的抑制作用［2］。相比未固定化的黄孢原毛平革，固定化的黄孢原毛平革菌降解土霉素的降解率具有显著优势，及酶的活性也高于未固定化的黄孢原毛平革。菌酶活性是因为海藻酸钙能有效固定菌体，防止振荡培养与机械搅拌因剪切力对降解酶系统带来的破坏，稳定系统，相比游离菌，锰过氧化物酶与木质素过氧化物酶明显提升了产量与稳定性，保障较高的降解率与酶活性。

从上述实验中得出，固定化的黄孢原毛平革菌在降解土霉素时，有显著的效果，优于非固定化的黄孢原毛平革菌，由于有载体，便于营养传递物质，促进菌丝体有效伸展，海藻酸钙固定化对白腐菌的生长与产酶非常有利，提高系统中菌体细胞酶的纯度或者浓度，具有较快的反应启动，取得了显著的降解效果，比悬浮条件更加优越，此外，还有耐高负荷能力，耐毒性与抑制杂菌的功能等。

锰过氧化物酶是糖基化过氧化物酶的一种，在培养黄孢原毛平革菌过程中，固定化与未固定化的黄孢原毛平革菌在培养96h后，两种样品的锰过氧化物酶在土霉素的浓度维持在70mg/L时，达到最大。在培养过程中，未固定化的黄孢原毛平革菌，具有较低的锰过氧化物酶活。这主要在于经过固定化的黄孢原毛平革菌，对在振荡培养过程中出现的机械剪切力能较好地应对，减少了细胞外酶失活与降解反应机器关闭。实验结果表明，适当的增加土霉素的浓度，会提高酶的活性，当超过一定限度时，酶的活性随浓度增加而降低［3］。

［1］王慧.黄孢原毛平革菌遗传转化初探和锰过氧化物酶基因在瑞氏木霉中的表达［D］.山东大学，2013.

［2］李芳玲.基于重金属及抗生素双重作用下黄孢原毛平革菌的富集特性和抗性研究［D］.湖南大学，2014.

［3］罗湘颖.黄孢原毛平革菌降解土霉素和吸附金属镉的研究［D］.湖南大学，2014.

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1674-2060（2016）01-0020-02