去氧乙烯基环己烯致雌鼠卵巢功能衰竭的动物模型研究进展

耿利华, 谈 勇

(南京中医药大学, 南京 210023)

·综 述·

去氧乙烯基环己烯致雌鼠卵巢功能衰竭的动物模型研究进展

耿利华, 谈 勇

(南京中医药大学, 南京 210023)

卵巢功能早衰(premature ovarian failure, POF)是一种以卵巢功能提前衰退为主要特征的生殖系统疾病。POF发病率虽高,但早期发现并诊断为POF的患者甚少，限制了对疾病的研究，因此建立与人类相似的生殖内分泌和组织学变化的POF模型对于POF发病机制的研究和进一步的治疗具有很大价值。实验中可以通过多种方法成功制备POF动物模型。本文主要从去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide，VCD)注射浓度的大小，注射时间的长短，利用不同日龄的雌鼠，不同物种，及与卵泡的募集、生长、发育和凋亡密切相关的众多调控因子等方面综述VCD诱导的卵巢功能衰竭模型的研究进展。

去氧乙烯基环己烯(VCD); 卵巢功能早衰(POF); 研究进展; 动物模型

目前临床上还缺乏卵巢功能早衰(premature ovarian failure, POF)的明确诊断标准, Pouresmaeili等[1]认为妇女在40岁以前出现闭经, 促性腺激素(folliele stimulating hormone，FSH)与黄体生成素(luteinizing hormone，LH)升高，雌激素(estrogens)与抑制素(inhibins)降低是POF的表现。广义的POF是指高促性腺激素性闭经，包括POF和卵巢不敏感综合征。卵巢不敏感综合征(insensitive ovary syndrome，IOS)是指原发性闭经或30岁前继发性闭经, 内源性FSH升高, 卵巢内有始基卵泡和窦状卵泡存在, 但对外源性FSH不敏感，因此卵泡不能发育成熟[2,3]。POF是由于卵巢合成性激素功能低下或者不能合成,降低了对下丘脑-垂体轴的负反馈作用，导致FSH升高和雌激素降低的一种状态。可以导致一系列生殖与健康问题，包括低雌激素所带来的生殖功能问题、心理问题及非生殖问题，近10年来POF在育龄妇女中发生率有逐年升高且向低龄化的发展趋势，对其诊治的研究越来越受到重视[4]。所以建立与人类在生殖内分泌和组织学变化方面相似的POF模型对于其发病机制的研究和进一步的治疗具有很大的临床意义。

实验中常用的动物模型具有各自的优缺点, 但均是从单一方面模拟妇女POF，不能很好模拟妇女POF的生理性过程, 而近几年来出现的4-乙烯基环己烯(VCD)诱导POF动物模型, 展现了明显的优势。

1 常用POF动物模型

1.1 卵巢摘除模型

人工摘除雌性育龄未妊娠鼠双侧卵巢。建模成功后，血清雌二醇(E2)含量显著降低，子宫脏器系数降低，此模型成功地模拟了人类更年期时出现的较低雌激素水平，但未能模拟出人类更年期从无到有、从前到后的转化过程。然而,大部分绝经妇女保留了卵巢组织，去卵巢模型则缺乏由残存卵巢组织分泌雄激素的能力，不能体现人类卵巢中雄激素对剩余卵巢组织的影响[5]。

1.2 基因敲除模型

该模型对阐述POF发生机制有重要作用，但是往往一种基因敲除模型只能解释一个或几个基因，而POF的发生不仅仅是一个基因的缺陷或突变所导致，因此不能完全解释POF的病因，其后续治疗等方面也有其局限性，同时此模型造模成本较高，相对难以推广应用。

1.3 半乳糖血症模型

此模型是一种常染色体隐性遗传疾病, 是由于半乳糖在代谢过程中，酶功能的缺陷而导致半乳糖代谢障碍和体内半乳糖及其代谢产物在血和组织中堆积而引起的一种代谢功能紊乱的症候群[6]。半乳糖血症的发病率为1/60 000～1/40 000[7]。半乳糖血症导致的POF临床病例很少，缺乏实用临床意义。

1.4 自身免疫性动物模型

将2～4日龄新生小鼠的胸腺切除后，与母鼠同笼喂养，造模成功时出现急性卵巢炎的表现和大量的卵泡被淋巴细胞浸润与破坏，然后出现卵巢萎缩和抗卵细胞、抗(ZP)抗体[8]。此模型只是从免疫学方面来探讨与POF的关系，不能够模拟POF的逐步变化过程。

1.5 化疗模型

实验中化疗药物所致POF模型常用的药物有紫杉醇、顺铂和环磷酰胺, 此模型主要研究医源性因素对POF的影响, 也不能模拟妇女生理性的POF过程。

1.6 自然衰老模型

Chakraborty等[9]研究表明，17月龄左右的老年鼠虽已进入无明显动情周期状态，但发情状态持续存在。2年龄的老年鼠也仍然具有大量的初级卵泡，但是这与人类POF患者的卵巢内几乎没有原始卵泡的状态截然不同。

上述造模方法都是针对POF的不同病因而设，因此具有一定的局限性，只适用于不同类型POF的实验研究。近年来，应用VCD诱导POF动物模型，进行了多方面研究。对本病发病机制研究及临床治疗奠定了理论基础。

2 VCD诱导动物模型

VCD是4-乙烯环己烯 (4-vinylcyclohexene，VCH)的代谢产物,是由1,3-丁二烯的二聚体构成, 而1,3-丁二烯是制造杀虫剂、灭火剂、橡胶、塑料等的副产品。环境化学物质VCD是一种新型的卵巢毒性物质, 可以理想地模拟出POF的生理过程。以下将从各个方面介绍VCD诱导POF模型的进展。

2.1 卵泡凋亡

Hu Xiaoming等[10]研究表明VCD能激活原始卵泡和初级卵泡中与凋亡有关的细胞内信号通路，尤其是增加原始卵泡和初级卵泡中的前凋亡基因Bax、Bad的表达，增加线粒体膜上Bax/Bcl-xl的比值(Bcl-xl为抑制凋亡基因), 使细胞色素C(与细胞凋亡有关)由线粒体向胞质释放，Caspase-3(属于半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶族的一分子，为凋亡效应子)活性增强等,这些均证实了VCD所致的POF是通过加速卵泡凋亡即卵泡闭锁的过程来实现。

Chabra等[11]报道, 暴露于VCH的工人抱怨有刺鼻气味和头痛, 暴露于VCD的工人称其对皮肤有刺激性。因此推测暴露于VCH或VCD的人们可能就蕴含着潜在的健康危害。已有动物实验[12-14]表明，VCD能选择性地破坏雌鼠和灵长类动物的原始卵泡和初级卵泡,加速卵泡凋亡,最终引起雌鼠和灵长类动物POF。进一步研究[15]表明VCD是直接作用于原始卵泡与初级卵泡的卵母细胞，加快卵泡闭锁。

细胞凋亡(apotosis)是一个细胞自我破坏的程序性过程，出现在正常生理状态或疾病中，在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程[16]。在正常情况下，卵泡颗粒细胞的分裂和凋亡现象一同发生, 当颗粒细胞凋亡达10%以上时，则预示着该卵泡闭锁[17]，提示细胞凋亡是导致卵泡闭锁的前提。由于出生时卵巢中始基卵泡的数目就已定, 卵泡闭锁又是卵巢正常生理机能的重要一部分, 是其生理性除掉多余组织的一个过程，所以少量卵泡的闭锁并不影响周围卵泡的正常发育， 只有当大量卵泡的闭锁速度快于生理代谢速度时，才可能发生POF。

2.2 不同VCD注射浓度、时间及不同实验对象

国外大量文献报道VCD对卵巢的影响因注射浓度、注射时间、雌鼠的日龄和物种的不同而不尽相同。

Muhammad等[18]研究显示，给平均129日龄SD大鼠连续15 d肌肉注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)，与对照组比，一侧卵巢原始卵泡和初级卵泡分别减少了80 %、76%; 而连续12～13 d肌肉注射VCD (160 mg·kg-1·d-1)，一侧卵巢原始卵泡和初级卵泡分别减少了90%、99%,但对次级卵泡均没有明显影响。给平均154日龄SD大鼠，连续30 d腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)，与对照组比，双侧卵巢原始卵泡和初级卵泡共减少了80%; 连续10～13 d腹腔注射VCD (160 mg·kg-1·d-1), 双侧卵巢原始卵泡和初级卵泡共减少了60%。前者与对照组比, 次级卵泡的数目减少。而后者次级卵泡数目并不低于对照组。给269日龄、28日龄SD大鼠连续30 d分别腹腔注射VCD(40 mg·kg-1·d-1),与对照组比, 269日龄大鼠原始卵泡与初级卵泡分别减少了48%和41.9%; 28日龄SD大鼠原始卵泡与初级卵泡分别减少了37.9%和19%; 同样方法, 采用80 mg·kg-1·d-1VCD, 269日龄大鼠原始卵泡与初级卵泡分别减少了90.7%和87.5%; 28日龄大鼠原始卵泡与初级卵泡分别减少了81.4%和68.3%。研究表明，尽管VCD对不同日龄大鼠的小卵泡影响颇为相似，但269日龄成年鼠因开始实验时其卵泡数目已明显少于28日龄大鼠，所以VCD处理后，可以很明显地看到卵泡数目下降。

Kao等[19]用28日龄雌性F344大鼠和B6C3F1小鼠分别腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)6 d、8 d、10 d、12 d后观察，与对照组比，在注射 8 d的小鼠卵巢中，首先观察到原始卵泡的闭锁，而大鼠直到注射10 d后才观察到原始卵泡的闭锁。在注射12 d，两种动物的初级卵泡与对照组比无统计学差异。在注射12 d后，才观察到大鼠与小鼠的原始卵泡和初级卵泡数目均减少, 但小鼠原始、初级卵泡的减少量要多于大鼠。VCD对卵泡的损伤程度大鼠和小鼠相似，但对小鼠卵泡的损伤要早于大鼠，表明小鼠更易受到VCD的卵巢毒性影响。

Lohff等[20]用160 mg·kg-1·d-1VCD给28日龄B6C3F1雌性小鼠连续腹腔注射10 d和20 d，结果显示，注射10 d后，与对照组比，小鼠卵巢中的原始卵泡和初级卵泡分别减少了93.2%、85.1%,注射10 d组小鼠达到POF平均需135 d, 注射20 d组小鼠平均只需52 d。

从以上实验中可以总结出VCD所造POF模型用不同日龄的雌鼠，成年鼠所需VCD剂量少; 相同日龄的雌鼠，VCD注射的时间长，则造模快; 与大鼠比，小鼠更易于受到VCD的卵巢毒性影响; 不同VCD浓度，浓度越大则成模越快。

2.3 凋亡调控蛋白

卵巢中卵泡的募集、生长、发育与凋亡是众多调控因子共同参与的结果，如Bcl-2、Bax、细胞色素C、Caspases(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)-3、Caspases-6、Caspases-9等，VCD诱导大鼠POF的机制与以上因子密切相关。

Bcl-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白质[21]。Bcl-2家族成员根据在细胞凋亡过程中的作用可以分为两类: 一类是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xl等; 另一类是促凋亡蛋白，包括Bax、Bad等[22]。根据Caspases在级联反应的上下游位置及功能的不同, 可以分为三类。Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9等位于级联反应的上游即为凋亡始动子; 位于级联反应的下游即为凋亡效应子,包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等。卵巢颗粒细胞凋亡是通过线粒体途径即细胞内源性途径介导的，凋亡刺激信号使Bax直接与线粒体膜结合,形成线粒体跨膜通道, 诱导线粒体向细胞质释放细胞色素C, 细胞色素C与凋亡促进因子1、Caspase-9形成复合物，在dATP与ATP的作用下，活化

根据Caspases在级联反应的上下游位置及功能的不同，可以分为三类。Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9等位于级联反应的上游即为凋亡始动子;位于级联反应的下游即为凋亡效应子，包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等。卵巢颗粒细胞凋亡是通过线粒体途径即细胞内源性途径介导的，凋亡刺激信号使Bax直接与线粒体膜结合,形成线粒体跨膜通道，诱导线粒体向细胞质释放细胞色素C, 细胞色素C与凋亡促进因子1、Caspase-9形成复合物，在dATP与ATP的作用下，活化Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等凋亡效应子，使凋亡进一步进行下去[15]。其中Caspases的活化又促进了这一过程，这样对于凋亡的加速和凋亡信号传递有十分重要意义。

Hu等[10]给28日龄雌性F344大鼠连续15 d腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)。15 d后与对照组相比，Bad在小窦卵泡中表达量增加，Bcl-xl与Bax无差异; Bcl-xl在线粒体中的表达水平下降，在细胞质的表达水平则增加。Bax蛋白在亚细胞结构的分布与对照组比没有差异。在细胞质与线粒体中Bad蛋白分布都增加。Bax/Bcl-xl的比例在发生凋亡细胞的线粒体膜上升高。

可见VCD所导致大鼠卵泡细胞凋亡与蛋白Bad、Bax表达量的增加、Bcl-xL重新分布、Bax/ Bcl-xL的比值增加和细胞色素C从线粒体向细胞质转移有密切关联。

Hu 等[23]另一项类似研究表明, 注射15 d后, 在直径为25～100 μm小卵泡细胞质中的Caspase-3的活性增加, 在小卵泡中Procaspase-3蛋白表达量增加了212%; 原始卵泡与小初级卵泡中的卵母细胞和颗粒细胞的细胞质中Caspase-3蛋白表达量增加, 小卵泡中Caspase-8的活性增强, 而Caspase-9在注射1 d后小卵泡线粒体中的活性增加。

2.4 性激素、动情周期的观察

VCD能够选择性地破坏雌鼠和灵长类动物的原始卵泡与初级卵泡，逐渐减少啮齿类动物的卵泡,因此其甾体类固醇激素如E2、孕激素(P)、睾酮(T)等和评估卵巢储备的FSH、LH、抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone, AMH)、抑制素B(inhibin B, INHB)等激素也将会受到影响。

Zhu等[24]给28日龄SD雌性大鼠连续14 d腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)，停药后30 d，FSH、LH升高，E2下降，类似于绝经状态。Reis等[25]给28日龄Wistar雌性大鼠连续15 d腹腔注射VCD (160 mg·kg-1·d-1)，停药后60～70 d，P、T和双氢睾酮(DHT)水平升高，而FSH、E2无变化。Mayer等[26]给28日龄F344雌性大鼠连续30 d腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)，停药后90 dFSH开始升高。

Lohff等[20]给28日龄B6C3F1雌性小鼠连续10 d腹腔注射VCD(160·kg-1·d-1)，停药后34 d，FSH升高; 连续注射20 d，停药后15 d，FSH升高。Lohff等[27]给28日龄C57B1/6雌性小鼠连续15 d腹腔注射VCD(160 mg·kg-1·d-1)，观察了12个性周期。VCD组1～4个周期长短(平均5.8 d)、FSH水平与对照组无统计学差异; 5～12个周期，VCD组周期比对照组平均延长10.9 d，同时FSH水平明显升高; 1～12个周期, E2和孕酮(P4)水平无显著变化。

3 VCD诱导POF模型的优点

VCD所致POF动物模型与常用造模方法相比具有如下优点: (1)能很好模拟生理性的POF，能够动态模拟妇女POF的过程。它能选择性破坏雌鼠卵巢中的小卵泡(原始卵泡和初级卵泡)，对大卵泡(次级卵泡和成熟卵泡)无直接影响。由于募集阶段的小卵泡数目减少, 导致血清FSH、LH升高, E2下降, 卵泡耗竭而致POF, 它是一个逐步变化的过程。(2)它对性腺以外的其它器官几乎无影响[28]。(3)VCD引起POF的机制是增加卵泡闭锁的速度, 卵巢和子宫组织学检查并未见明显的炎性细胞浸润。

制备良好的POF模型应符合下列几个条件[29]: (1)动情周期紊乱; (2)卵泡数目显著减少; (3)血清FSH明显升高，E2明显降低。以上3点符合妇女POF疾病特征，反应了POF所导致的卵巢损伤。VCD所造POF模型能够很好地模拟妇女生理性的POF。能够动态演示POF逐步变化的过程。因此利用VCD建立与人类相似的生殖内分泌和组织学变化的POF模型对于POF发病机制的研究和治疗药物的开发具有非常重要的临床意义。

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Research Progress on Premature Ovarian Failure Animal Model induced by Vinylcyclohexene Diepoxide

GENG Li-hua, TAN Yong
(Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

Premature ovarian failure(POF) is a reproductive system disease as the main characteristics of ovarian function decline in advance.Although the high morbidity, there are few patients found and diagnosed early,which limits the study of the disease. Accordingly establishing the POF animal model which is similar to anthropic reproductive endocrinology and histological changes is of great value to POF pathogenesis reseach and further treatment.In experiments, POF model can be prepared by many methods, but current animal models of POF fail to adequately replicate this particular stage in female life. The article states the research progress of POF model induced by 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) mainly on the diverse injection concentration, different injection time, disparate day age, distinct species and a large amount of regulatory factors which closely participated in follicular recruitment, growth and apoptosis.

4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD); Premature ovarian failure (POF); Research progress; Animal model

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0404-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.018

2016-07-04

上海海天医药科技开发有限公司(2015026)

耿利华(1989-), 女, 硕士研究生, 研究方向: 不孕症。E-mail: 280582831@qq.com

谈 勇。 E-mail: 574294491@qq.com