糖多酚A对辐射损伤小鼠的防护作用

糖多酚A对辐射损伤小鼠的防护作用

刘娟洪阁杨澍纪海莹陈龙刘天军

300192天津，中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所（刘娟、洪阁、纪海莹、陈龙、刘天军）；300140天津市第四中心医院药物临床试验机构（杨澍）

目的通过建立137Cs γ射线诱导的辐射损伤小鼠模型，探讨通过结构修饰而得到的糖多酚A的辐射防护作用。方法4～6周龄的雄性昆明种小鼠42只，用随机数字表法分为阴性对照组（NCG）、阳性对照组（PCG）、照射对照组（ICG）以及糖多酚A的0.05、0.10和0.20 g/kg 3个剂量组。采用6.0 Gy137Cs γ射线单次全身照射构建小鼠电离辐射损伤模型。射线照射前连续给药14 d，照射后继续给药7 d。照射后第7天处死小鼠，观察不同剂量的糖多酚A对小鼠脏器系数、外周血指标、脾结节数、骨髓DNA含量和股骨有核细胞数的影响。结果与ICG比较，糖多酚A 0.05、0.10、0.20 g/kg剂量组均可有效抑制照射后7 d小鼠免疫系统和造血系统的辐射损伤，使脾脏系数（Z=-2.364、-3.003、-2.747，均P＜0.05）和内源性脾结节数均显著升高（Z= -2.458、-2.141、-2.206，均P＜0.05），其中糖多酚A 0.05 g/kg和0.20 g/kg剂量组白细胞数显著升高（Z=-2.652、-2.139，均P＜0.05），糖多酚A 0.20 g/kg剂量组红细胞数（Z=-2.364，P＜0.05）、骨髓DNA含量（Z=-2.492，P＜0.05）和股骨有核细胞数（Z＝-2.492，P＜0.05）也显著高于ICG。结论糖多酚A可通过改善脏器系数，增高内源性脾结节数、外周血白细胞数、骨髓DNA含量和股骨有核细胞数来缓解电离辐射所致损伤，促进小鼠免疫和骨髓造血功能的恢复。

结构修饰；糖多酚A；电离辐射；外周血；脾结节；骨髓DNA

0 引言

电离辐射可导致头晕、乏力、食欲下降、免疫力降低、白细胞数降低、造血系统损伤、染色体畸变等症状[1]，故辐射防护药物的研发受到社会的广泛关注。过去辐射防护剂在国内外的研究主要集中于合成化合物上[2-3]。研究结果表明，一大批植物提取物和草药制剂在体内外均具有很好的辐射防护作用[4-5]。植物中富含大量多酚物质，且已有研究结果证实这些多酚类物质具有潜在的辐射防护作用[6]。植物多酚可通过抗氧化、DNA修复等机制对辐射造成的皮肤损伤具有显著保护作用[7]。其中，茶多酚不仅能显著增加辐射后小鼠的红细胞数、白细胞数和血红蛋白含量，还能增加辐射后小鼠的脾脏系数和胸腺系数，从而起到辐射防护作用[8]。

植物多酚[8-9]虽具有强大的辐射防护作用，但其存在生物利用度低、提取困难等缺点。本课题组通过对多酚化合物进行结构修饰得到含有糖化基团的多酚类结构——糖多酚A（图1）。糖多酚A是以木糖与多酚为原料反应而得，并经红外光谱、紫外光谱、核磁波谱和质谱表征[10]；不仅降低了多酚的毒性、提高了生物利用度，同时制备简捷，可弥补植物多酚的不足。此外，糖多酚A还具有良好的抗氧化活性和增强机体免疫力的功能[10]。据报道，植物中提取的多酚-多聚糖轭合物具有很好的辐射防护活性[11]，因此推测糖多酚A也应具有一定的辐射防护作用。本研究主要观察糖多酚A对小鼠免疫器官（脾脏和胸腺）以及外周血、骨髓DNA含量的影响；同时，考察糖多酚A对股骨有核细胞数的改变，以探讨糖多酚A对电离辐射所致免疫和造血等辐射敏感器官受损以及活动能力降低等的防治作用。

图1 糖多酚A的结构

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

SPF级雄性昆明种小鼠42只，4～6周龄，18～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物使用许可证号SCXK（京）2014-0004。注射用氨磷汀（国药准字H20010403，大连美罗大药厂），糖多酚A（中国医学科学院生物医学工程研究所自制）。Gammacel 40137Cs γ射线照射源（加拿大原子能有限公司），BC-2800全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），Hettich Zentrifugen 110离心机（德国Hettich公司），BX53正置荧光显微镜（日本Olympus公司）；VarioskanFlash3001全波长多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药方案

小鼠饲养条件为光照12 h，饲养温度25～27℃，湿度40%。适应性喂养4 d后，将小鼠按体质量大小编号，用随机数字表法进行完全随机化分组：阴性对照组（negative control group，NCG）、阳性对照组（positivecontrolgroup，PCG）、照射对照组（irradiation control group，ICG）以及糖多酚A的0.05、0.10和0.20 g/kg 3个剂量组，每组7只。NCG、PCG和ICG每天灌胃去离子水；糖多酚A的3个剂量组分别给予相应剂量的糖多酚A，1次/d，灌胃14 d。第14天给药后，除NCG不给予照射外，其余各组均给予137Cs γ射线单次全身照射，吸收剂量为6.0 Gy，剂量率为0.905 2 Gy/min[12]，其中PCG于照射前30 min腹腔注射氨磷汀0.25 ml（16 mg/ml）。照射后继续给药7 d，照射前每2天记录1次体质量，照射后每天记录体质量，并同时记录饮食量。

1.2.2 小鼠脾脏系数和胸腺系数检测

小鼠接受6.0 Gy射线单次全身照射后7 d，对小鼠称体质量，眼球取血处死，收集脾脏和胸腺并称质量，按脏器质量（mg）/体质量（g）计算脏器系数。

1.2.3 小鼠外周血指标检测

小鼠接受6.0 Gy137Cs γ射线单次全身照射后7 d，对小鼠摘眼球取血，用全自动血液细胞分析仪检测白细胞数、红细胞数和血红蛋白含量。具体方法参照文献[13]进行。

1.2.4 小鼠脾结节数、骨髓DNA含量和股骨有核细胞数的测定

将取出的脾脏称质量后放入Bouin液内固定，约24 h后取出，用体积分数为70%的乙醇溶液冲洗去大部分黄色，肉眼计数突出脾脏表面的结节数。照射后7 d，小鼠眼球取血处死后取一侧股骨，参照文献[14]测定DNA含量；取另一侧股骨，用白细胞稀释液冲洗骨髓，再于荧光显微镜下观察股骨有核细胞并计数[15]。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，所有计量资料均以均值±标准差（x±s）表示，组间比较用秩和检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 糖多酚A对受照小鼠体质量的影响

经6.0 Gy137Cs γ射线照射后，小鼠体质量明显下降，其中NCG、PCG和糖多酚A 0.10 g/kg剂量组小鼠的体质量下降较少，且照射后这3组小鼠的体质量均明显高于ICG组，表明氨磷汀和0.10 g/kg剂量的糖多酚A对受照小鼠的体质量均有明显的提高。（图2）

图2 糖多酚A对6.0 Gy137Cs γ受照小鼠体质量的影响

2.2 糖多酚A对受照小鼠脏器系数的影响

图3 糖多酚A对6.0 Gy137Cs γ射线受照小鼠脾脏系数的影响

经6.0 Gy137Cs γ射线照射后7 d，小鼠脾脏和胸腺严重受损，与NCG比较，ICG小鼠的脾脏系数和胸腺系数均显著降低（Z=-3.130、-2.492，均P＜0.05）。与PCG比较，糖多酚A各剂量组小鼠的脾脏系数、胸腺系数差异均无统计学意义（均P＞0.05）。受照后7 d，与ICG相比，糖多酚A各剂量组小鼠的脾脏系数和胸腺系数均有不同程度的升高，其中糖多酚A 0.20g/kg剂量组小鼠的脾脏系数升高显著（Z=-2.364，P＜0.05），0.05 g/kg剂量组和0.10 g/kg剂量组小鼠的胸腺系数亦升高显著（Z=-1.981、-2.364，均P＜0.05）。这表明糖多酚A与氨磷汀均可有效抑制脾脏细胞和胸腺细胞的辐射损伤，促进脾脏细胞增殖，增加脾脏质量。（图3、4）

2.3 糖多酚A对受照小鼠外周血的影响

经6.0 Gy137Cs γ射线照射后7 d，与NCG比较，ICG小鼠白细胞数、红细胞数和血红蛋白浓度均显著降低（Z=-3.137、-2.364、-3.130，均P＜0.05）。与PCG比较，糖多酚A各剂量组小鼠的白细胞数、红细胞数和血红蛋白浓度差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与ICG相比，糖多酚A各剂量组白细胞数、红细胞数和血红蛋白浓度均呈上升趋势，但未见明显的剂量-反应关系，其中糖多酚A 0.05 g/kg剂量组和0.20 g/kg剂量组与ICG比较，白细胞数（Z= -2.625、-2.139，均P＜0.05）和血红蛋白浓度（Z=-2.108、-1.981，均P＜0.05）差异均有统计学意义；糖多酚A 0.20 g/kg剂量组与ICG相比，红细胞数差异具有统计学意义（Z=-2.364，P＜0.05）。上述结果表明，糖多酚A与氨磷汀对于辐射损伤小鼠的外周血指标有一定的提升作用，且低剂量与高剂量组的提升作用更明显。（图5～7）

2.4 糖多酚A对受照小鼠骨髓DNA含量、脾结节和股骨有核细胞数的影响

图4 糖多酚A对6.0 Gy137Cs γ射线受照小鼠胸腺系数的影响

经6.0 Gy137Cs γ射线照射后7 d，与NCG比较，ICG小鼠骨髓DNA含量和股骨有核细胞数显著减少，脾结节数显著增加，差异均有统计学意义（Z=-3.134、-3.130、-2.245，均P＜0.05）。与PCG比较，糖多酚A 0.20 g/kg剂量组小鼠骨髓DNA含量、股骨有核细胞和脾结节数差异均有统计学意义（Z=-3.134、-3.130、-0.966，均P＜0.05）。与ICG比较，糖多酚A 0.05、0.10、0.20 g/kg剂量组均可增加受照小鼠的骨髓DNA含量、股骨有核细胞数和脾结节数，其中脾结节数差异均有统计学意义（Z=-2.458、-2.141、-2.206，均P＜0.05），但未见明显剂量依赖性；糖多酚A 0.20 g/kg剂量组小鼠骨髓DNA含量和股骨有核细胞数增加亦较为显著（Z=-2.492、-2.492，均P＜0.05）。提示与糖多酚A相比，氨磷汀能显著改善辐射所致的免疫系统和造血系统的损伤，但糖多酚A 0.20 g/kg剂量组的作用也较为显著。（图8～10）

图5 糖多酚A对6.0Gy137Csγ射线受照小鼠外周血白细胞数的影响

图6 糖多酚A对6.0Gy137Csγ射线受照小鼠外周血红细胞数的影响

图7 糖多酚A对6.0Gy137Csγ射线受照小鼠外周血血红蛋白的影响

图8 糖多酚A对6.0 Gy137Cs γ射线受照小鼠骨髓DNA的影响

图9 糖多酚A对6.0 Gy137Cs γ射线受照小鼠脾结节数的影响

图10 糖多酚A对6.0 Gy137Cs γ射线受照小鼠股骨有核细胞数的影响

3 讨论与结论

辐射能造成机体一系列的生理损伤，其中免疫抑制和造血系统损伤是造成死亡的主要原因[8]。免疫细胞以及脾脏、胸腺等参与免疫调节的脏器是高辐射敏感的细胞群；而射线对于造血系统的损伤主要是抑制或破坏造血干细胞，常造成骨髓抑制、微循环障碍、白细胞数下降等造血微环境破环[16]。杨映雪等[17]研究结果表明，黄酮类可通过降低辐射对小鼠外周血白细胞的损伤、明显提高受照小鼠脾脏系数和增加脾结节数，从而促进放射损伤后造血系统和免疫系统的重建。因而本研究选取免疫系统（脾脏和胸腺）和造血系统（外周血、骨髓DNA、脾结节和股骨有核细胞）[1]作为评价对象。脾脏和胸腺是重要的免疫器官，脾脏系数和胸腺系数反映了生物体的免疫功能。骨髓是主要的造血组织，经射线照射后，会造成DNA断裂和外周血中白细胞、红细胞、血小板数降低；而脾结节和股骨有核细胞数也代表了机体造血组织恢复的能力[1]，小鼠内源性脾结节计数曾被作为一种筛选抗辐射药物的方法[15]。

在本研究中，经6.0 Gy137Cs γ射线照射后，小鼠免疫系统和造血系统均受到严重损伤，表现为脾脏和胸腺严重受损，小鼠的脾脏系数和胸腺系数显著降低；同时，小鼠白细胞数、红细胞数、骨髓DNA含量、脾结节和股骨有核细胞数亦显著下降，说明动物辐射损伤造模成功。然而，在对小鼠喂食糖多酚A后，上述检测指标均有不同程度的改善。研究结果显示，糖多酚A各剂量组均能提高免疫器官脾脏系数和胸腺系数，说明糖多酚A能很好地促进免疫系统的恢复；同时，能不同程度地提高受照小鼠的外周血指标、骨髓DNA含量、脾结节和股骨有核细胞数，表明糖多酚A在促进免疫系统恢复的同时还能加速造血系统的恢复，从而起到辐射防护作用。笔者采用了文献报道的评价方法，具有一定的可行性，故糖多酚A具有抗辐射作用。当然，糖多酚A这种保护作用机制和药物的构效关系还有待更深入的研究。

利益冲突无

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Protective effect of sugar polyphenols A on radiation injury in mice

Liu Juan,Hong Ge,Ji Haiying,Yang Shu, Chen Long,Liu Tianjun
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China(Liu J,Hong G,Ji HY,Yang S,Chen L,Liu TJ);Drug Clinical Trial Institution,Tianjin Fourth Centre Hospital,Tianjin 300140,China(Yang S)

ObjectiveTo study the radiation protection effect of sugar polyphenols A obtained by structured modification using mouse model of radiation injury induced by137Cs γ-ray.MethodsTotal 42 male Kunming mice aged 4-6 weeks were randomly divided into six groups:negative control group(NCG),positive control group(PCG), irradiation control group(ICG)as well as three irradiation experimental groups.The radiation injury model was developed by once whole-body irradiation with 6.0 Gy137Cs γ-ray.The mice in three experimental groups were fed sugar polyphenols A respectively with doses of 0.05,0.10 and 0.20 g/kg,for 14 d before irradiation,and continuously fed with the drug for 7 d after the irradiation.After that the mice were sacrificed,and the organ index,hematological parameters,spleen colony number,bone marrow DNA content and nucleated cells in bone-marrow were tested to evaluate the effect of sugar polyphenols A.ResultsCompared with the ICG,the irradiation experimental groups with the sugar polyphenols A doses of 0.05,0.10,0.20 g/kg showed reductions in irradiation injuries of immune system and hematopoietic system,which makes the significant increases of the spleen indexes(Z=-2.364,-3.003 and -2.747,P＜0.05)and the number of endogenous spleen colony(Z=-2.458,-2.141 and-2.206,P＜0.05).In the groups with the doses of 0.05 and 0.2 g/kg,the number of white blood cells were significantly increased(Z=-2.652 and-2.139, P＜0.05).Besides,in the group with the dose of 0.2 g/kg,the level of red blood cells(Z=-2.364,P＜0.05),bone marrow DNA content(Z=-2.492,P＜0.05)and nucleated cells in bone-marrow(Z=-2.492,P＜0.05)were also increased compared with the ICG.ConclusionsSugar polyphenols A has the positive effects on the recovery of immune and hematopoietic function of mice through improving the organ index,endogenous spleen colony number,peripheral white blood cell number,bone marrow DNA content and nucleated cells in bone-marrow,which can reduce the injury induced by ionizing radiation.

Structural modification;Sugar polyphenols A;Ionizing radiation;Hematological parameters;Endogenous spleen colony;Bone marrow DNA

Liu Tianjun,Email:liutianjun@hotmail.com

2016-08-07）

刘天军，Email:liutianjun@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2016.06.004