大鼠EZH2基因过表达质粒以及催化亚基缺失质粒构建及鉴定

熊显佳杨冰赵秀娟孙琰赵建松武莉莉刘艺洁张玲

300070天津医科大学基础医学院（熊显佳、杨冰、赵秀娟、孙琰、武莉莉、刘艺洁、张玲）；300402天津渤海职业技术学院电气工程系（赵建松）

大鼠EZH2基因过表达质粒以及催化亚基缺失质粒构建及鉴定

熊显佳杨冰赵秀娟孙琰赵建松武莉莉刘艺洁张玲

300070天津医科大学基础医学院（熊显佳、杨冰、赵秀娟、孙琰、武莉莉、刘艺洁、张玲）；300402天津渤海职业技术学院电气工程系（赵建松）

目的构建特异性的大鼠EZH2过表达质粒以及EZH2催化亚基SET domain缺失质粒，并在293T细胞中评估其表达水平。方法提取大鼠心脏组织RNA，逆转录为cDNA，重叠PCR扩增催化亚基SET domain缺失的EZH2的cDNA，以其为模板进行PCR扩增，将PCR产物和载体双酶切，切胶回收目的片段，经T4连接酶连接，连接产物转入感受态细胞，涂板挑取单克隆摇菌测序，提取质粒，采用脂质体转染法转染293T细胞。结果Western Blot法和RT-PCR法检测结果表明，质粒在293T细胞中实现EZH2基因的过表达。结论构建的2种质粒为进一步研究EZH2基因与心肌肥厚的关系及EZH2催化亚基的作用奠定了基础。

EZH2；催化亚基；重组质粒；心肌肥厚

Fund program:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81500170);NaturalScienceFoundationofTianjin, China(15JCYBJC25400,16JCQNJC12100,16JCQNJC10300);Tianjin Science and Technology Development Fund Project for Colleges and Universities(20130103);Scientific Research Foundation for Returned Scholars,Ministry of Education,China

0 引言

心脏疾病是死亡率的最高的疾病之一[1-2]。组织损伤和内分泌紊乱等可以刺激心脏通过增生塑性改变维持心肌能量输出[3-5]。心肌肥厚是最初的适应性反应，但持久的肥厚最终导致心脏功能衰竭、生命终结[6]。心肌肥厚的发生常伴随多种信号途径，并在转录过程达到顶点[7-9]。深入探讨心肌肥厚相关信号转导通路有助于心肌肥厚的预防和治疗。

胚胎祖细胞以及其分化后代是通过组蛋白甲基化稳定转录过程。在生命进程中，这种调节对实现和维持基因的表达和压力反应可能极为关键。多梳复合体起到稳定心肌相关基因的表达的功能，同时在其他系统中控制着细胞的特性和后生的记忆[10]。EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是多梳抑制复合体2（polycomb repressive complex 2,PRC2）中主要的组蛋白甲基转移酶，通过其高度保守的SET区域可对组蛋白H3第27位赖氨酸进行三甲基化，调节染色体的结构，从而实现抑制转录。研究证实，组蛋白修饰与多种疾病发生发展的信号通路相关，EZH2在包括肿瘤在内的多种疾病的发病机制中起重要作用。在胚胎心肌祖细胞分化过程中，稳定EZH2介导的Six1的抑制作用对于正常心肌生长和压力反应很重要，对于抑制致命基因的表达EZH2起到前示作用，同时通过Six1的抑制作用得到加强[11]。

为了揭示EZH2基因对于心肌肥厚发生发展中的意义，本研究运用多种生物学手段从大鼠心脏组织中构建大鼠EZH2过表达质粒以及EZH2催化亚基SET domain缺失质粒，并在人293T细胞中进行验证。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

2×Trams Taq HiFi PCR SuperMix II、高保真PCR扩增试剂（北京全式金生物技术有限公司），载体Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR（苏州金唯智生物科技有限公司），293T细胞（美国ATCC细胞库），逆转录试剂盒、DNA纯化回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司），质粒中提试剂盒（美国Biomiga公司），T4 DNA连接酶、DH5a感受态细胞、限制性内切酶BamHI、限制性内切酶Not 1（大连宝生物工程有限公司），鼠源β-actin单克隆抗体（上海艾博抗贸易有限公司），兔源EZH2单克隆抗体、兔源H3单克隆抗体、兔源H3K27me3单克隆抗体（德国密理博有限公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（美国Cell signaling），SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司），胎牛血清、高糖DMEM培养基（上海玉博生物科技有限公司），胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司），ECL化学发光液（上海碧云天生物技术有限公司）。Tanan 4500全自动化学发光图像分析仪（济南博鑫生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 EZH2过表达质粒构建

依据GeneBank大鼠EZH2 mRNA序列进行引物设计，上下游分别引入BamHI、Not1酶切位点，设计的引物序列：上游引物5'CGGGATCCATGGGCCAGACTGGGAAGA 3'，下游引物5'TCCCCCGGGTCAAGGGATTTCCATTTCTCGTTC 3'。以大鼠心肌提取RNA逆转录cDNA为模版进行PCR。PCR反应体系：灭菌水13.3 μl，10×Pyrobest Buffer II 2 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μl，Pyrobest DNA Polymerase（5 U/μl）0.1 μl，模板DNA 1 μl，Primer 1（10 μmol/L）1 μl，Primer 2（10 μmol/L）1 μl。反应条件98℃10 s、60℃30 s、72℃92 s，30个循环。

1.2.2 EZH2催化亚基SET domain缺失质粒构建

采用重叠PCR法，设计的引物序列——F1：CGGGATCC ATGGGCCAGACTGGGAAGAAAT；R1：GCTGTATTTAGAGCCCCGCTGAATG；F2：TCTA

AATACAGCCAGGCTGATGCCC；R2：TTGCGGCCGCTCAAGGGATTTCCATTTCTCG。分别用引物F1和R2及F2和R1进行配对，进行PCR。PCR条件：2×TransTaq HiFi PCR SuperMix II，94℃5 min、94℃15 s、55.5℃30 s、68℃3 min（1～2 kb/min），30个循环之后68℃8 min。分别回收第2步所得2条PCR产物。将第3步所得2份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Taq酶进行PCR。PCR条件：2×TransTaq HiFi PCR SuperMix II，94℃5 min、94℃15 s、55.5℃30 s、68℃3 min（1～2 kb/min），30个循环之后68℃8 min。

1.2.3 PCR产物和载体双酶切

PCR产物双酶切（Not 1和BamHI）体系：Not 1（10 U/μl）1 μL，BamHI（15 U/μl）1 μl，10×T Buffer 1 μl，0.1×BSA 2 μl，Substrate PCR DNA 1 μg，补ddH2O到20 μl，反应条件为30℃3 h。

载体双酶切体系：Not 1（10 U/μl）1 μl，BamHI（15 U/μl）1 μl，10×T Buffer 1 μl，0.1×BSA 2 μl，Substrate载体DNA 1 μl，补ddH2O到20 μl。反应条件为30℃3 h。PCR产物和载体酶切产物分别进行DNA凝胶电泳并进行胶回收，2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收DNA片段。

1.2.4 质粒连接

体系：T4 DNA连接酶350 U/μl 1 μl、10×T4 DNA连接酶缓冲液2 μl、胶回收后的PCR酶切产物0.4 μg、胶回收后的载体酶切产物0.2 μg、补充ddH2O到总体积为20 μl、反应温度25℃2 h，转化至DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆于LB（Luria-Bertani）培养基中，送菌液进行测序。

1.2.5 重组质粒转染

测序无误后的细菌于LB培养基中扩大培养，质粒中提。293T细胞于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞增殖到80%左右时，进行病毒转染。将细胞以适宜的密度接种到6孔培养板上，待细胞达到90%汇合度左右时，配置所需溶液。每孔：溶液1：200 μl无血清培养基+10 μl脂质体2000，温育10 min；溶液2：X μl无血清培养基+4 μg质粒，将2种溶液混合，室温30 min，同时用无血清培养基冲洗6孔板中的细胞，冲洗2遍后，加入2 ml无血清培养基，逐滴将2种溶液的混合液加入孔中，轻轻晃动培养板，混合均匀。在37℃、5%的CO2中培养8～12 h后，更换含有血清的完全培养基；再于37℃、5%的CO2中培养48～72 h，加嘌呤霉素进行药筛。

1.2.6 Western Blot检测融合蛋白在293T细胞中的表达

将病毒感染药筛后的细胞培养，待达到一定汇合度后，胰酶消化细胞，收集细胞悬液，1 200 r/min离心5 min；弃去上清，加入PBS清洗，1 200 r/min离心5 min；弃去上清，加入细胞裂解液，充分混匀，冰浴30 min，4℃，12 000 r/min，离心20 min；转移上清至新的1.5 ml离心管中，按BCA蛋白质在定量试剂盒说明书，用分光光度计对蛋白进行定量。向蛋白液中加入4×Loddingbuffer，混匀，100℃，煮沸10min，保证蛋白质充分变性。配置聚丙烯酰胺凝胶，按定量的结果，取50 μg上样量，80 V待Marker分开，120V跑至溴酚蓝到达分离胶底部，进行转膜，300mA 2h，将蛋白转移至NC膜上；用含5%脱脂牛奶的TBST封闭NC膜2 h，兔单抗EZH2（1∶1 000），H3K27me3（1∶3 000），H3（1∶5 000），鼠单抗β-actin（1∶3 000），4℃孵育过夜，用TBST于摇床上洗3次，每次10min；用山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（1∶3 000）室温孵育2 h，TBST于摇床上洗3次，每次10 min；ECL化学发光液显色，Tanan 4500全自动化学发光图像分析仪扫描，ImageJ软件进行灰度分析。

1.2.7 实时荧光定量PCR法检测转录水平EZH2的表达

实验分为3组：①CD510-B-1空载组。②CD510-B-1-EZH2过表达组。③CD510-B-1-EZH2-SET1组。收集3组经嘌呤霉素药筛后的细胞，加入Trizol，充分混匀，按Trizol法提取细胞中总的RNA，取出1 μg RNA进行逆转录，RT-PCR扩增cDNA片段，引物序列：EZH2上游5'gttggcggaagcgtgtaaagactin 3'，下游5'gtatccttcgctgcttccattc3'，β-actin上游5'TTGCTGACAGGATGCAGAAG3'，下游5'ATCCACATCTGCTGGAAGGT3'。PCR反应体系：Mix 10 μl，primer F 0.4 μl，primer R 0.4 μl，Rox 0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl。反应条件：95℃5 min；95℃15 s，60℃1 min，共循环40次，95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。1.3统计学方法

Western Blot结果以Bandscan软件图像分析。使用SPSS10.0数据统计软件ANOVE和Tukey对组间数据进行处理和分析，所有数值以均值±标准差（x±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒鉴定结果

Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR图谱及EZH2基因SET domain位置如图1所示，BamHI和Not 1为双酶切位点，同时在目的基因EZH2示意图中标示出SET domain位置。

图1 Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR图谱与基因EZH2的SET domain位置

EZH2/Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR图谱及EZH2-SET1/Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR重组质粒的鉴定结果如图2所示。1～6分别为DNA Marker，EZH2基因过表达质粒经BamHI、Not 1双酶切，EZH2基因过表达质粒经BamHI单酶切，DNAMarker，EZH2催化亚基SET domain缺失质粒经BamHI、Not 1双酶切，EZH2催化亚基SET domain缺失质粒经BamHI、Not 1单酶切。如图1所示，2种重组质粒经BamHI/Not 1双酶切以及BamHI单酶切鉴定后，所得片段与预期片段吻合。

图2 E2H2/Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR及EZH2-SET1/LentipCDH-CMV-puro-VECTOR重组质粒的鉴定结果

此外，分别采用PCR和重叠PCR法获得目的序列产物，产物与载体分别双酶切，酶切产物切胶回收后进行连接，连接产物涂板，挑取单菌落测序，经GeneBank BLAST比较，测序结果与目标片段序列吻合。（图3）

2.2 EZH2与H3K27me3蛋白在293T细胞中的表达

经慢病毒转染并经嘌呤霉素药筛后的细胞，培养起来后收集细胞提取蛋白。采用Western Blot法分别检测了EZH2和H3K27me3蛋白的表达量（图4）。如图所示，对于EZH2过表达组，可在293T细胞中实现EZT2蛋白（P＜0.01）与H3K27me3蛋白（P＜0.05）的过表达；但对于EZH2催化亚基SET domain缺失组，仅可在293T细胞中实现EZH2蛋白的过表达（P＜0.01），而在H3K27me3蛋白表达量无明显变化。此外，对于E3K27me3蛋白表达水平，EZH2过表达组与EZH2催化亚基SET domain缺失组相比其表达量增加，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。与正常293T细胞相比，感染后的细胞的EZH2蛋白表达量以及其作用下游蛋白H3K27me3的表达量明显上调，从蛋白水平上说明EZH2基因在293T细胞当中成功实现了过表达。

2.3 EZH2 mRNA在293T细胞中的表达

经慢病毒转染的细胞，收集细胞加入Trizol提取RNA，经逆转录后进行RT-PCR，扩增目的基因EZH2，结果如图5所示。与正常293T细胞组相比，感染组EZH2 mRNA的表达量明显上调（P＜0.001），从mRNA水平上验证EZH2基因在293T细胞中成功实现了过表达。

3 讨论与结论

心脏病是危害人类健康和生命的3大疾病之一[12]。心肌肥厚是在如压力，神经体液因子以及心肌基因突变等作用下心肌细胞出现的一种适应性反应。早期的心肌肥厚对维持心肌正常的功能有益，但肥厚过程提高了心肌耗氧量，引起心肌顺应性下降。因此，持续的心肌肥厚将导致心力衰竭和死亡。心肌肥厚是多种心脏疾病发生发展中的一个较为重要的阶段，但其形成机制目前尚未完全阐明。近年来的研究揭示了一些与心肌肥厚相关的信号传导通路，包括Ca2+及其相关的通路，PIP3激酶通路，以及MAPK通路和JAK、STAT通路等。研究方法主要集中在通过构建心肌肥厚动物模型来揭示心肌肥厚的形成机制。因此，研究心肌肥厚的分子机制，进而找到一个有效而精准的治疗方法对于增加心肌肥厚患者的存活率极为重要。

图3 A EZH2基因过表达质粒测序结果;B EZH2催化亚基SET domain缺失质粒测序结果

图4 EZH2和H3K27me3在293T中的蛋白表达水平

图5 EZH2的mRNA的表达量

随着基因组学研究的发展，疾病发生机制中基因的表观遗传修饰日益受到重视，主要包括DNA以及组蛋白的甲基化和乙酰化修饰，其中转录水平修饰被认为与很多信号通路以及疾病的发生相关。EZH2作为PRC2复合体中主要的组蛋白甲基转移酶，可引起组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化。有报道称，MicroRNA-214通过抑制EZH2发挥，可促进心肌细胞肥大[13-14]。同时，EZH2以及相关的H3K27三甲基化在心肌细胞中表达，使H3K27三甲基化的水平在心肌祖细胞分化为心肌细胞过程中增加，能够诱导和调控干细胞向心肌细胞分化[15]。但是关于EZH2与心肌肥厚的关系尚存争论，有研究显示，增加EZH2的稳定以及功能可抑制心肌肥厚的产生[16]，而前期的研究也表明EZH2与心肌肥厚可能存在关联。

EZH2基因SET domain区域在结构上高度保守，对于EZH2发挥甲基化功能至关重要。EZH2基因本身片段比较大，SET domain区域缺失减少了目的基因的片段长度，导致形成重组质粒的几率更大。因此，与EZH2过表达质粒相比，SET domain缺失质粒在293T细胞中表达效率更高，感染几率更大。在研究EZH2基因与心肌肥厚关系中，探究SET domain区域的缺失对于EZH2基因与心肌肥厚的相互关联中具有重要意义。

为了研究EZH2在心肌肥厚发生发展过程中的作用，以及EZH2催化亚基的作用，本研究构建了大鼠特异性EZH2过表达质粒与EZH2催化亚基缺失SET domain质粒，并通过测序证实。Western Blot与RT-PCR检测结果表明，与对照组相比，转染细胞的EZH2蛋白与mRNA实现了过表达。研究结果为下一步大鼠中EZH2与心肌肥厚的关系以及EZH2催化亚基对EZH2的整体重要性的研究提供了基础。

利益冲突无

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Construction and identification for the EZH2 gene overexpression plasmid and EZH2 catalytic subunit SET domain deletion plasmid in rats

Xiong Xianjia,Yang Bing,Zhao Xiujuan,Sun Yan,Zhao Jiansong,Wu Lili,Liu Yijie,Zhang Ling
School of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China(Xiong XJ,Yang B,Zhao XJ, Sun Y,Wu LL,Liu YJ,Zhang L);Department of Electrical Engineering,Tianjin Bohai Vocational Technical College, Tianjin 300402,China(Zhao JS)

ObjectiveTo constructe the rat-specific EZH2 overexpression plasmid and the EZH2 catalytic subunit SET domain deletion plasmid,as well as assess their levels of expression in 293T cells.MethodsThe RNA extracted from rat cardiac tissue was reverse-transcribed into cDNA,the cDNA of catalytic subunit SET domain deleted EZH2 was amplified by overlap PCR,then the PCR amplification was achieved using the EZH2 gene as template.Products through PCR amplification and vector were cut with double enzyme,and then ligated the target fragments,purified by gel extraction,using T4 ligase.The ligated products were transferred into competent cells.After plate coating,monoclonal picking,shaking cultivation and sequencing procedures,the plasmids were extracted and transfected into 293T cells using liposome-mediated method.ResultsWestern Blot and RT-PCR assays showed recombinant plasmids DNA can successfully overexpress EZH2 gene in 293T cells.ConclusionsTwo plasmids were successfully constructed.This study laid the foundation for the further study on the relationship between EZH2 and myocardial hypertrophy,and the function of EZH2 catalytic subunit.

EZH2;Catalytic subunit;Recombinant plasmid;Cardiac hypertrophy

Zhang Ling,Email:zhanglsl@tmu.edu.cn

国家自然科学基金（81500170）；天津市自然科学基金（15JCYBJC25400，16JCQNJC12100，16JCQNJC10300）；天津市高等学校科技发展基金计划项目（20130103）；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目

2016-08-12）

张玲，Email：zhanglsl@tmu.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．06．002