杜仲松脂醇二葡萄糖苷的提取工艺优化

潘亚磊，郭玲丽，谢　培，宋忠兴，唐志书，王　梅

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西

咸阳 712083；2.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；3.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)



杜仲松脂醇二葡萄糖苷的提取工艺优化

潘亚磊1，郭玲丽2，谢培1，宋忠兴1，唐志书1，王梅3

(1.陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西

咸阳 712083；2.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；3.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

摘要：首先采用二水平实验筛选出提取杜仲松脂醇二葡萄糖苷的主要影响因素：乙醇体积分数、浸泡时间和提取次数；再以提取物中松脂醇二葡萄糖苷含量为指标，通过正交实验优化提取工艺。确定最优提取工艺为：将粉碎的杜仲皮以料液比1∶12(g∶mL)加入75%乙醇后浸泡24 h，超声提取2次，每次20 min。在此条件下，提取物中松脂醇二葡萄糖苷的平均含量为1.51%。该优化提取工艺简单、快速、高效。

关键词：杜仲；松脂醇二葡萄糖苷；提取工艺；二水平实验；正交实验

杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)是我国特有的药用植物，为国家二级保护植物。杜仲皮是人们熟知的传统名贵中药，《神农本草经》将其列为上品，谓其“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨，除阴下痒湿，小便余沥。久服，轻身耐老”。近代药理学研究表明,杜仲中的木脂素类成分不仅可通过抑制血管重构治疗高血压[1-2]，而且可以防治绝经后骨质疏松[3]。松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinoldiglucoside，PDG)是杜仲中含量最丰富的木脂素类化合物之一，其结构见图1。PDG是杜仲降血压和治疗骨质疏松的主要活性成分[4-5]，也是2015年版《中华人民共和国药典》控制杜仲质量的参照化合物[6]。目前对杜仲总木脂素的研究较多，且主要采用紫外分光光度法测定木脂素含量[7-9]。

作者在此首先采用二水平实验筛选出提取杜仲PDG的主要影响因素：乙醇体积分数、浸泡时间和提取次数；再以提取物中PDG含量为指标，采用HPLC法精确测定PDG含量，通过正交实验优化提取工艺，拟为从杜仲中高效提取PDG奠定基础。

图1　松脂醇二葡萄糖苷的结构式

1实验

1.1材料、试剂与仪器

杜仲药材，陕西兴盛德药业有限责任公司。

PDG对照品(批号 lot20140618，含量≥98%)，宝鸡晨光生物科技有限公司；高效液相色谱用超纯水；甲醇，色谱纯，Adamas-beta公司；其余试剂均为分析纯。

e2695型高效液相色谱仪，Waters；SY-2000型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；FW-1000AD型快速开盖高速万能粉碎机，天津鑫博得仪器有限公司；FA2704b型分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司；KQ-300DE型数控超声清洗器，昆山超声仪器有限公司；Vaco5型冷冻干燥机，ZRBUS；电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2PDG提取工艺流程

杜仲皮100 g→粉碎→过筛→加入溶剂→浸泡→超声/回流提取→抽滤→滤液减压浓缩→转移至平皿-80 ℃预冻→低温冷冻干燥→得到粉末状固体。

1.3PDG提取工艺优化

1.3.1二水平实验

Plackett-Burman设计是一种二水平实验方法，可用最少的实验次数使因素尽可能精确地估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出主要的影响因素供进一步研究[10]。

本实验采用Plackett-Burman设计对影响杜仲PDG提取效果的11个因素进行考察，以筛选主要影响因素。

1.3.2正交实验

根据二水平实验结果，选取乙醇体积分数、提取次数、浸泡时间作为主要因素，进行三因素三水平正交实验，进一步优化杜仲PDG提取工艺。

1.4PDG含量测定

采用HPLC法精确测定PDG浓度，按下式计算PDG含量(Y)：

式中：x为供试品中PDG浓度，mg·mL-1；V为供试品体积，mL；m为干燥杜仲皮粉末质量，mg。

2结果与讨论

2.1色谱方法学考察

2.1.1色谱条件

Waters e2695-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：277 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：25 ℃；流动相：甲醇-水(25∶75，体积比)；进样量：10 μL。空白、标准品及供试品的高效液相色谱见图2。

2.1.2对照品溶液的配制

精密称取PDG对照品0.7 mg，加入50%甲醇溶解，定容于5 mL量瓶中。

2.1.3标准曲线的绘制

取对照品溶液配制成系列浓度(mg·mL-1)：0.00175、0.00350、0.00700、0.01400、0.02800、0.05600、0.14000，通过高效液相色谱分离测定。以峰面积(y)为纵坐标、PDG浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得线性方程为：y=4×106x-6442.6，R=0.9976。表明，PDG浓度在0.00175～0.14000 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.4精密度实验

精密吸取PDG对照品溶液0.1 mL，稀释至标准曲线线性范围内，按色谱条件测定峰面积。重复测定5次，RSD为0.33%，表明该方法精密度较高。

2.1.5稳定性实验

精密吸取PDG对照品溶液0.1 mL，并稀释至标准曲线线性范围内，按色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h测定峰面积。RSD为2.03%，表明该方法稳定可靠。

图2空白(a)、PDG标准品(b)、供试品(c)的高效液相色谱

Fig.2HPLC of blank(a)，PDG standard(b)，sample(c)

2.1.6回收率实验

精密称取6种不同条件下所提取的PDG粉末适量，用甲醇溶解，过滤，取1.5 mL于样品瓶中，再精密加入0.1 mL PDG对照品溶液，通过高效液相色谱测定，计算平均回收率为99.0%，RSD为1.31%。

2.2提取工艺优化

2.2.1二水平实验

选择7个实际因素[料液比(A)、提取方式(B)、乙醇体积分数(C)、提取时间(D)、粉碎程度(E)、提取次数(F)、浸泡时间(G)]及4个虚拟因素(H、I、J、K)进行实验次数为12的Plackett-Burman设计，7个实际因素与水平见表1，结果见表2。

表1Plackett-Burman设计因素与水平

Tab.1　Factors and levels of Plackett-Burman design

表2Plackett-Burman设计结果

Tab.2　Results of Plackett-Burman design

由表2可知，乙醇体积分数(C)、提取次数(F)、浸泡时间(G)对PDG含量的影响最大，影响率均大于20%，而料液比、提取方式、提取时间、粉碎程度对PDG含量的影响较小。因此，为方便实验、节约能源，在药材粉碎程度为10目、料液比为1∶12(g∶mL，下同)、提取时间为20 min、超声提取方式下，对乙醇体积分数、提取次数、浸泡时间3个主要因素进行进一步的优化实验。

2.2.2正交实验

文献[11]报道，当只考察实验因素自身的影响而不考察因素间的交互影响时，所选用的正交表列号应比因素数多一列或相等，故本实验选用L9(34)正交表进行优化实验，正交实验的因素与水平见表3，结果与分析见表4，方差分析见表5。

表3正交实验因素与水平

Tab.3　Factors and levels of orthogonal experiment

表4正交实验结果与分析

Tab.4　Results and analysis of orthogonal experiment

表5方差分析

Tab.5　Variance analysis

2.2.3验证实验

在最优提取工艺条件下，重复3次实验，以验证该工艺的合理性和稳定性。结果无显著性差异，RSD值为1.32%，PDG的平均含量为1.51%。因此，确定3个主要影响因素为：乙醇体积分数75%、提取2次、浸泡时间24 h。

2.3讨论

(1)影响杜仲PDG提取的因素较多，本实验首先采用二水平实验对影响因素进行了考察，在所选水平范围内，筛选出了3个主要因素；同时，二水平实验结果发现，采用超声和加热回流对提取PDG结果影响相当，因此选用超声法提取PDG，与吕强[12]的研究结论相同。

(2)杜仲中PDG不仅具有重要药理学活性，而且其含量的高低还是判断杜仲生药及其产品质量的重要指标。杜仲中PDG含量和杜仲生长年限密切相关[13]，《中华人民共和国药典》2015年版规定PDG含量应大于0.10%[6]，可见PDG在杜仲中的总体含量较低，本实验优化建立的PDG提取工艺为充分利用杜仲资源奠定了基础。

3结论

首先采用二水平实验筛选出提取杜仲松脂醇二葡萄糖苷的主要影响因素：乙醇体积分数、浸泡时间和提取次数；再以提取物中松脂醇二葡萄糖苷含量为指标，通过正交实验优化提取工艺。确定最优提取工艺为：将粉碎的杜仲皮以料液比1∶12(g∶mL)加入75%乙醇中浸泡24 h，超声提取2次，每次20 min。在此条件下，提取物中松脂醇二葡萄糖苷的平均含量为1.51%。该优化提取工艺简单、快速、高效。

参考文献：

[1]GU J, WANG J J,YAN J,et al.Effects of lignans extracted fromEucommiaulmoidesand aldose reductase inhibitor epalrestat on hypertensive vascular remodeling[J].Journal of Ethnopharmacology,2011,133(1):6-13.

[2]LUO L F,WU W H,ZHOU Y J,et al.Antihypertensive effect ofEucommiaulmoidesOliv.extracts in spontaneously hypertensive rats[J].Journal of Ethnopharmacology,2010,129(2):238-243.

[3]ZHANG R,PAN Y L,HU S J,et al.Effects of total lignans fromEucommiaulmoidesbarks prevent bone lossinvivoandinvitro[J].Journal of Ethnopharmacology,2014,155(1):104-112.[4]SIHCJ,RAVIKUMARPR,HUANGFC,etal.Isolationandsynthesisofpinoresinoldiglucoside,amajorantihypertensiveprincipleofTu-Chung(Eucommiaulmoides,Oliver)[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1976,98(17):5412-5413.

[5]林芳.杜仲治疗骨质疏松的有效成分筛选及质量控制的研究[D].成都：成都中医药大学，2012.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2015年版一部.北京:中国医药科技出版社,2015:165.

[7]彭密军，吕强，彭胜，等.杜仲总木脂素的超声波辅助提取工艺研究[J].林产化学与工业，2013，33(4)：89-92.

[8]潘亚磊，翟远坤，牛银波，等.响应面分析法优化杜仲总木脂素提取工艺[J].中成药，2014，36(1)：182-185.

[9]邓翀，颜永刚，杨乖利，等.正交试验设计优化杜仲总木脂素提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2011，18(8)：45-46.

[10]AHUJA S K,FERREIRA G M,MOREIRA A R.Application of Plackett-Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium[J].Biotechnology and Bioengineering,2004,85(6):666-675.

[11]徐吉民.正交法在医药科研中的应用[M].北京：中国医药科技出版社,1987：109-110.

[12]吕强.杜仲总木脂素及松脂醇二葡萄糖苷的提取纯化研究[D].吉首：吉首大学，2013.

[13]王姣，周日宝，单自强，等.湘产杜仲中松脂醇二葡萄糖苷动态变化[J].中成药，2014，36(11)：2363-2366.

Optimization on Extraction Process of Pinoresinol Diglucoside fromEucommiaUlmoidesOliv.

PAN Ya-lei1,GUO Ling-li2,XIE Pei1,SONG Zhong-xing1,TANG Zhi-shu1,WANG Mei3

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine,ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,ShaanxiProvinceKeyLaboratoryofNewDrugsandChineseMedicineFoundationResearch,Xianyang712083,China;2.CollegeofPharmacy,ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046,China;3.TheAffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712000,China)

Abstract：A 2-level experiment was employed to screen the main factors(volume fraction of ethanol,soaking time,extraction times) for the pinoresinol diglucoside extract from Eucommia ulmoides Oliv..Using extraction content of pinoresinol diglucoside as an index,the optimal extraction conditions were optimized by orthogonal experiment.The optimal extraction process was as follows:the pulverized Eucommia ulmoides Oliv.cortex was soaked in 75% ethanol by solid-liquid ratio of 1∶12(g∶mL) for 24 h,then extracted 2 times by ultrasonic,and each time of 20 min.Under above conditions,the average content of pinoresinol diglucoside was 1.51%.The optimized extraction process was simple,fast and efficient.

Keywords：Eucommia ulmoides Oliv.;pinoresinol diglucoside;extraction process;2-level experiment;orthogonal experiment

中图分类号：TQ 351

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)02-0042-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.009

作者简介：潘亚磊(1984-)，男，河北邢台人，博士，讲师，主要从事中药药理及骨质疏松的防治研究，E-mail：panyalei588@163.com。

收稿日期：2015-11-02

基金项目：陕西省科技厅项目(2015SF073)，陕西省科技统筹创新工程计划项目(2011KTCL03-05)，陕西省科技资源开放共享平台项目(2015FWPT-01)