红薯发酵产丁醇的工艺优化

田毅红，朱志豪，高　媛，张雨婷，李文林，龚大春

(三峡大学生物与制药学院，湖北 宜昌 443003)



红薯发酵产丁醇的工艺优化

田毅红，朱志豪，高媛，张雨婷，李文林，龚大春

(三峡大学生物与制药学院，湖北 宜昌 443003)

摘要：对以红薯为原料、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇的工艺条件进行了优化，考察了红薯浓度、外加氮源及浓度、乙酸钠添加量对发酵的影响。结果表明：当红薯浓度为8%、乙酸铵浓度为2%(即碳氮比为20)、乙酸钠添加量为0.4%时，发酵液中丁醇含量达到最高，为14.410 mg·mL-1，较优化前显著提高。为发酵法产丁醇的工业化生产奠定了基础。

关键词：丙酮丁醇梭菌；丁醇；发酵；红薯

丙酮丁醇梭菌发酵产物的主要成分为丙酮、丁醇和乙醇(简称总溶剂，ABE)，比例为3∶6∶1，其中，丁醇占丙酮丁醇梭菌发酵总产物的60%以上。丁醇是一种重要的有机溶剂，也是一种极具潜力的新型生物燃料，具有能量密度和燃烧值高、蒸汽压低、易与汽油混合等优点，已成为生物质能源的研究热点。目前，我国常用的发酵产丁醇的淀粉质原料为玉米、小麦等，不仅“与人争食”，而且生产成本偏高，所以开发廉价原料发酵产丁醇具有重大的现实意义。湖北宜昌地区红薯资源丰富，价格便宜，与广西的木薯类似。因此，作者对以新鲜红薯为原料、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇的工艺进行优化，拟为红薯资源的开发利用提供有效途径，也为发酵法产丁醇的工业化生产奠定基础。

1实验

1.1材料、菌种与培养基

新鲜红薯、玉米粉等。

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，由艾伦·麦克德尔米德再生能源研究所提供。

种子培养基: 称取5g玉米粉加入100mL水配制5%[g干物质·(100mL)-1，下同]玉米粉，于沸水浴糊化15min，121 ℃蒸煮灭菌30min。

红薯培养基：称取8g新鲜红薯加入100mL水配制8%红薯粉，用榨汁机打浆[1]，沸水浴糊化15min，121 ℃蒸煮灭菌30min。

1.2方法

培养基灭菌后冷却，按5%的接种量接种后，于100 ℃水浴中热处理75s，同时通入无菌氮气，以排净培养基及试管中氧气，再放入37 ℃恒温培养箱中静置培养72h。采用气相色谱法及DNS法分别测定发酵液中的丁醇及残糖含量。通过单因素实验分别考察红薯浓度、外加氮源及浓度、乙酸钠添加量等对发酵产丁醇的影响，以确定最优发酵工艺。

1.3分析测试

(1)新鲜红薯含水量的测定：采用恒重法。

(2)新鲜红薯淀粉含量及发酵液残糖含量的测定：准确称取一定量的新鲜红薯或发酵液，酸解后用DNS法测定发酵液中残糖含量，按下式计算红薯淀粉含量。

红薯淀粉含量=淀粉含糖量×0.9/(1-含水量)

(3)发酵液中丁醇含量的测定：采用气相色谱法。色谱条件：FID检测器，载气为氮气，AT-PEG-20M毛细管色谱柱(50m×0.25mm，0.5μm)，柱温70 ℃，进样口温度220 ℃，检测器温度230 ℃，进样量2.0μL，不分流。采用内标法，异丁醇作为内标物，采用N2000气相色谱工作站进行数据分析。

2结果与讨论

2.1新鲜红薯的分析结果

经测定，新鲜红薯含水量为78.16%，淀粉含量为12.33%，折合后红薯干淀粉含量为57.35%。

2.2发酵条件的优化

2.2.1红薯浓度对发酵的影响

分别配制红薯浓度为2%、4%、5%、6%和8%的红薯培养基，接种后于37 ℃下恒温静置培养72 h，测定发酵液中丁醇含量，结果见图1。

图1　红薯浓度对发酵的影响

由图1可看出，发酵液中丁醇含量随培养基中红薯浓度的增大而不断增加，在红薯浓度为8%时达到10.275 mg·mL-1。实验发现，红薯浓度超过8%时，糊化后呈半固体状，发酵液黏稠，造成传质困难，且发酵到72 h时菌体还在旺盛生长(即发酵还未到终点)，会延长发酵周期。考虑到菌体的生长和发酵周期等因素，选择培养基中红薯浓度为8%。

2.2.2外加氮源对发酵的影响

玉米中的蛋白质和脂肪含量明显高于木薯、红薯等薯类原料。以红薯为原料可能会因为培养基中氮源偏低影响丙酮丁醇梭菌的正常生长[2-3]。因此，在培养基中分别外加初始碳源(红薯)浓度(质量分数，下同)2%的氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、尿素和乙酸铵等5种氮源进行发酵，测定发酵液中残糖和丁醇含量，结果见图2。

图2　外加氮源对发酵的影响

由图2可看出，添加初始碳源浓度2%的乙酸铵为外加氮源时，发酵液中丁醇含量最高，达到13.391 mg·mL-1。因此，外加氮源以乙酸铵为最佳。

2.2.3外加氮源浓度对发酵的影响

以乙酸铵为外加氮源，分别在其浓度为1%、2%、3%、4%、5%时进行发酵，测定发酵液中残糖和丁醇含量，结果见图3。

图3　外加氮源浓度对发酵的影响

由图3可看出，在外加氮源浓度为2%，即碳氮比为20时，残糖含量最低、丁醇含量最高，为13.096 mg·mL-1；在外加氮源浓度为5%时，菌体几乎没有生长，无丁醇产生，说明过高浓度的乙酸铵对丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇有抑制作用[4]。因此，外加氮源乙酸铵的浓度以2%为最佳。

2.2.4乙酸钠添加量对发酵的影响

乙酸钠在丙酮丁醇梭菌发酵中的主要作用是与乙酰辅酶 A 结合生成乙酰乙酰辅酶 A，作为丙酮和丁醇共同的前体物质，该物质的增加能提高丁醇的产量，且乙酸钠还对丙酮丁醇梭菌细胞内pH值有缓冲作用[5]。因此，可以通过外加乙酸钠实现对代谢流的调控。在红薯培养基中分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的乙酸钠进行发酵，测定发酵液中丁醇含量，结果见图4。

图4　乙酸钠添加量对发酵的影响

由图4可看出，在乙酸钠添加量为0.4%时，发酵液中丁醇含量达到最高，为10.406 mg·mL-1。因此，乙酸钠添加量以0.4%为最佳。

2.3验证实验

依据单因素实验结果，在最优条件(即红薯浓度8%、乙酸铵浓度2%、乙酸钠添加量0.4%)下进行验证实验，发酵液中丁醇含量达到14.410 mg·mL-1，较优化前大幅提升。表明优化工艺可行，对红薯发酵产丁醇的工业化生产有指导意义。

3结论

对以红薯为原料、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇的工艺条件进行了优化，考察了红薯浓度、外加氮源及浓度、乙酸钠添加量对发酵的影响。结果表明：当红薯浓度为8%、乙酸铵浓度为2%(即碳氮比为20)、乙酸钠添加量为0.4%时，发酵液中丁醇含量达到最高，为14.410 mg·mL-1，较优化前显著提高。为发酵法产丁醇的工业化生产奠定了基础。

参考文献：

[1]庞宗文，俸雪，吴三星，等.以新鲜马铃薯为原料发酵丙酮丁醇的研究[J].可再生能源，2012，30(11):83-86.

[2]沈兆兵，刘钺，杜风光，等.木薯发酵丙酮丁醇工艺优化与放大[J].现代化工，2011，31(10):69-71.

[3]李鑫，李志刚，史仲平，等.原料碳氮比对丁醇发酵两阶段发酵性能的影响[J].食品与生物技术学报，2014，33(11)：1168-1175.

[4]宋钢，郑璞，倪晔，等.木薯发酵产丁醇的研究[J].生物加工过程，2012，10(2):6-10.

[5]徐芳.丙酮丁醇梭菌生产丁醇及代谢调控的初步研究[D].无锡：江南大学，2009.

Optimization on Fermentation Conditions of Butanol from Sweet Potato

TIAN Yi-hong,ZHU Zhi-hao,GAO Yuan,ZHANG Yu-ting,LI Wen-lin,GONG Da-chun

(CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443003,China)

Abstract：Fermentation conditions of Clostridium acetobutylicum to produce butanol by using sweet potato as raw material were optimized.Effects of the concentration of sweet potato,the type and concentration of additional nitrogen source,and the dosage of sodium acetate on fermentation were investigated.The results showed that,when the concentration of sweet potato was 8%,the concentration of ammonium acetate was 2%(C/N value was 20),the dosage of sodium acetate was 0.4%，the content of butanol in fermentation broth reached 14.410 mg·mL-1，which obviously higher than that of non-optimization process.The study lays the foundation for industrialization of butanol production by fermentation.

Keywords：Clostridium acetobutylicum；butanol；fermentation；sweet potato

中图分类号：TQ 923

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)02-0064-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.014

作者简介：田毅红(1969-)，女，陕西人，副教授，主要从事生物化工、发酵方面的研究工作，E-mail：tyh1994@163.com。

收稿日期：2015-11-07