加味升阳益胃汤组方对荷瘤小鼠化疗后骨髓抑制及免疫功能的影响

张润莲　岳斌　李维　王宝琴　温丽英　刘冬彦　连平　何晓华　赵冬梅

075000　张家口，河北北方学院附属第一医院中医科(张润莲、岳斌、温丽英、连平、何晓华、赵冬梅)；河北省张家口市崇礼县中医院内科(李维)；河北省张家口市崇礼县妇幼保健院妇产科(王宝琴)；河北省张家口市沽源县医院内科(刘冬彦)



加味升阳益胃汤组方对荷瘤小鼠化疗后骨髓抑制及免疫功能的影响

张润莲岳斌李维王宝琴温丽英刘冬彦连平何晓华赵冬梅

075000张家口，河北北方学院附属第一医院中医科(张润莲、岳斌、温丽英、连平、何晓华、赵冬梅)；河北省张家口市崇礼县中医院内科(李维)；河北省张家口市崇礼县妇幼保健院妇产科(王宝琴)；河北省张家口市沽源县医院内科(刘冬彦)

【摘要】目的重点探究加味升阳益胃汤组方对荷瘤小鼠化疗的骨髓抑制及免疫功能的影响。 方法建立小鼠肉瘤 S180移植性肿瘤模型，并将小鼠分成五组，荷瘤细胞对照组腹腔注射生理盐水0.2 mL，环磷酰胺组注射环磷酰胺(cyclophosvnamide，CTX)20 mg/kg，三组治疗组分别给予注射同等剂量CTX化疗，同时给予不同剂量的加味升阳益胃汤组方，其中小剂量组每只中药灌胃0.1 mL，中剂量组每只中药灌胃0.2 mL，大剂量组每只中药灌胃0.3 mL，1 mL大约含有70 g生药量。结果环磷酰胺组小鼠的白细胞、血红蛋白及血小板均降低，荷瘤对照组和环磷酰胺组对比差异有统计学意义(P<0.05)。大剂量组、中剂量组、小剂量组的白细胞、血红蛋白及血小板均正常，大剂量组、中剂量组升高程度相对明显。三个剂量组和环磷酰胺组对比差异存在统计学意义(P<0.05)。结论加味升阳益胃汤组方能拮抗荷瘤小鼠化疗后引起的骨髓抑制及免疫功能的下降。

【关键词】加味升阳益胃汤组方；荷瘤小鼠；化疗；骨髓抑制；免疫功能

恶性肿瘤的发病率正呈逐年上升的趋势，严重威胁着人民的身体健康及生命。对于恶性肿瘤公认的治疗方法有化疗、放疗、介入、热疗、中医中药等，中医中药贯穿于肿瘤治疗的各个环节。化疗杀伤患者残存肿瘤细胞，但杀伤癌细胞的同时，对正常细胞也有一定的损害，同时也抑制机体免疫功能[1]，故骨髓抑制及免疫功能下降是化疗常见的并发症[2]，在治疗上一直困扰着临床大夫，选择有效、经济、实用、疗效较好的药物治疗骨髓抑制，提高机体免疫力，是保证顺利化疗的重要环节。本实验重点观察加味升阳益胃汤组方对荷瘤小鼠化疗后骨髓抑制及免疫功能的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物61只(其中1只用于接种小鼠肉瘤S180细胞株，其余60只进行实验)清洁级昆明雄性小鼠，7~8周龄，体质量约为24 g，购自北京实验动物繁殖中心；小鼠在实验前正常饲养环境，空调恒温室内22 ℃，自由饮水，每天光照2小时，训养1周。

1.1.2实验药物 (1)加味升阳益胃汤组方(购自河北北方学院附属第一医院中药房)药物组成：黄芪30 g、陈皮10 g、清半夏10 g、人参15 g、茯苓15 g、炒白术12 g、炙甘草6 g、羌活10 g、独活10 g、柴胡10 g、防风10 g、泽泻15 g、黄连6 g、当归10 g、花生内衣10 g、生姜3片、大枣6个，将这些中药浸泡大约半个小时，并煎煮及过滤至少三次，每次的时间大约是半个小时。接着取出汁液300 mL，使用80℃的水进行水浴浓缩，1 mL大约含有1 g生药量，使用80 ℃进行煎煮浓缩为30 mL，1 mL大约含有70 g生药量，4℃中保存。(2) 环磷酰胺(cyclophosvnamide，CTX)购自山西振东泰盛制药有限公司，批号：H20143566。

1.2方法

1.2.1建立小鼠肉瘤S180移植性肿瘤模型将小鼠肉瘤S180细胞株接种于其中一只小鼠腹腔，7天后予颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后抽取腹水，按1∶6生理盐水稀释，将细胞浓度调整为2×107个/mL。

1.2.2分组及给药方法60只昆明种小鼠的右腋皮下接种，每只大约0.2 mL。将小鼠随机分成五组，荷瘤细胞对照组每只灌胃生理盐水0.4 mL，腹腔注射生理盐水0.2 mL。磷酰胺组每只灌胃生理盐水0.4 mL，注射CTX 20 mg/kg。三组治疗组分别给予不同剂量的加味升阳益胃汤组方，小剂量组每只中药灌胃0.1mL，注射CTX 20 mg/kg；中剂量组每只中药灌胃0.2 mL，注射CTX 20 mg/kg；大剂量组每只中药灌胃0.3 mL，注射CTX 20 mg/kg。每只小鼠用药时间是接种瘤细胞24小时后，每天用药一次，持续用药10天。

1.2.3标本的收集与处理10天后小鼠颈椎脱臼处死，取血，EDTAK2抗凝，用全自动模块血液体液分析仪(型号XN-2000)；流式法化验血常规，摘取胸腺及脾称重，胸腺指数=胸腺重量(mg)/ 小鼠重量(g) 脾脏指数=脾脏重量(mg)/小鼠重量(g)。

1.2.4自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)活性的测定[3]无菌摘取脾脏，按常规制备脾细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液配成1×107个/mL的细胞浓度作为效应细胞。取传代培养的L929细胞，用0.25%胰酶消化液消化2分钟加入RPMI-1640完全培养液，调节细胞浓度至2×105个/mL作为靶细胞，在96孔平底板上每孔加入靶细胞悬液100 μL， 37℃、5%CO2培养90分钟，使其贴壁成单层细胞，然后实验孔加入100 μL效应细胞悬液，做4个复孔，靶细胞对照孔加完全RPMI-1640培养液100 μL，然后将96孔板放在孵箱中孵育20小时，去上清，用生理盐水轻轻注满各孔，反复3次，以除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分；每孔加入0.1%的中性红染液100 μL孵育30分钟，弃去染液，用生理盐水洗3遍，每孔加100 μL细胞裂解液，使含有中性红的靶细胞溶解，摇匀，用酶标仪在450 nm测光密度值(optical density,OD)，用以下公式计算杀伤率。

杀伤率(%)=(靶细胞OD值-实验组OD值)/靶细胞OD值×100%

1.2.5T淋巴细胞增值能力的测定[4]无菌摘取脾脏，常规制作脾细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液培养基重悬细胞，调节细胞浓度至5×106个/mL，加入96孔细胞培养板100 μL/孔，再分别加入ConA 100 μL/孔使其终浓度为6 μg/mL，将上述加好的培养板置37℃、5%CO2培养箱68小时后取出，每孔吸出10 μL，加入0.5 g/L的MTT 10 μg，置培养箱内培养4小时后取出，加10% SDS-HCl溶液100 μL/孔，振荡过夜，酶标仪测570 nm波长处OD值。以各样本A值代表其T淋巴细胞增值能力。

1.3统计学方法

2结果

2.1不同组别的化疗荷瘤小鼠白细胞、血红蛋白及血小板的对比

结果表明环磷酰胺组小鼠的白细胞、血红蛋白及血小板均降低，荷瘤对照组和环磷酰胺组对比差异存在统计学意义(P<0.05)。大剂量组、中剂量组、小剂量组的白细胞、血红蛋白及血小板均正常，大剂量组、中剂量组升高程度相对明显。三个治疗组和环磷酰胺组对比差异存在统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　不同组别对荷瘤小鼠白细胞、血红蛋白及

注： 与荷瘤对照组比较，aP<0.05；与环磷酰胺组比较，bP<0.05，

cP<0.01。

2.2不同组别的化疗荷瘤小鼠脏器指数的对比

结果表明，环磷酰胺组小鼠的脾脏指数、胸腺指数均降低，荷瘤对照组和环磷酰胺组对比差异存在统计学意义(P<0.05)。大剂量组、中剂量组、小剂量组的脾脏指数、胸腺指数均上升，大剂量组、中剂量组升高程度相对明显。三个治疗组和环磷酰胺组对比差异存在统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　不同组别的化疗荷瘤小鼠脏器指数的对比±s)

注： 与荷瘤对照组比较，aP<0.05；与环磷酰胺组比较，bP<0.05，

cP<0.01。

2.3不同组别的化疗荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖和NK细胞活性对比

结果表明环磷酰胺组的NK细胞活性显著降低，荷瘤对照组和环磷酰胺组对比差异存在统计学意义(P<0.05)。大剂量组、中剂量组、小剂量组的NK细胞活性均上升，大剂量组、中剂量组升高程度相对明显，三个治疗组和环磷酰胺组对比差异存在统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3　不同组别的化疗荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖

注： 与荷瘤对照组比较，aP<0.05；与环磷酰胺组比较，bP<0.05，cP<0.01。

3讨论

化疗药物均是细胞毒性药物，中医视为邪气，而这种邪气不同于一般的六淫之邪，它伤人快，肺先受邪，正气受损严重，故其病机是肺脾气虚，兼有湿热阻滞，治疗就应该采用健脾补肺、清热化湿的方法。加味升阳益胃汤组方正符合此要求，人参、茯苓、炒白术、陈皮、清半夏、炙甘草健脾益气；黄芪、防风、炒白术补益肺气；柴胡、羌活、独活风药胜湿；茯苓、泽泻健脾渗湿；黄连清热燥湿；当归、花生内衣、生姜、大枣和胃补血，诸药合用共奏健脾补肺、清热化湿、益气和胃、补气养血之功效[5]，具有增强免疫，防治骨髓抑制的综合治疗作用[6-11]。

本研究中，环磷酰胺组小鼠出现骨髓抑制，红细胞、白细胞、血小板均有不同程度的降低。大剂量组、中剂量组、小剂量组的小鼠无骨髓抑制症状。通过这些数据对比，有理由相信加味升阳益胃汤能够升高红细胞、白细胞及血小板。环磷酰胺组的NK细胞活性显著降低，而大剂量组、中剂量组、小剂量组的NK细胞活性均上升，大剂量组、中剂量组升高程度相对明显，说明加味升阳益胃汤能提高NK细胞的活性。环磷酰胺组小鼠的脾脏指数、胸腺指数均降低，大剂量组、中剂量组、小剂量组的脾脏指数、胸腺指数均上升，大剂量组、中剂量组升高程度相对明显。进一步表明加味升阳益胃汤能提高脾脏指数及胸腺指数。由此可见，加味升阳益胃汤组方能拮抗化疗引起的荷瘤小鼠骨髓抑制、提高免疫功能。

本实验针对中药全方位、多靶点调节的特点[12]，进一步了解加味升阳益胃汤的组方疗效，验证了该组方对肿瘤化疗时出现的骨髓抑制不良反应的治疗作用，并有提高免疫功能的作用，在一定程度上扩大了其应用范围，使其为更好地指导临床用药提供了一定的实验依据。但是，其详细的作用机理有待进一步研究。当然，本实验也存在着样本量偏少的不足，期待今后有更大样本、更精密的试验设计，使中医药更好地服务于临床。

参考文献

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(本文编辑： 韩虹娟)

Effects ofJiaweiShengyangYiweidecoction on bone marrow and immune function after chemotherapy in tumor-bearing mice

ZHANGRun-lian，YUEBin，LIWei，etal.TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of Jiawei Shengyang Yiwei decoction on on bone marrow and immune function after chemotherapy in tumor-bearing mice. MethodsTransplanted tumor in mice Sarcoma S180 model was established and mice were divided into five groups. Tumor cells control group was injected with 0.2 ml saline, CTX group was injected with cyclophosphamide, and three treatment groups were injected with CTX and were gavage with different dose of Jiawei Shengyang Yiwei decoction (0.1, 0.2, 0.3 ml). ResultsWhite cells, hemoglobin and blood platelet level decreased in mice in CTX group. There was significant difference between tumor cells control group and CTX group (P<0.05=. The white cells, hemoglobin, and blood platelet level of the three treatment group was normal, and much more obvious improvement appeared in high and medium dose group. There was significant difference between the three treatment groups and CTX group(P<0.05). ConclusionJiawei Shengyang Yiwei decoction could be antagonistic to the bone marrow suppression and immune function decline caused by chemotherapy in tumor-bearing mice.

【Key words】Jiawei Shengyang Yiwei decoction formula；Tumor-bearing mice；Chemotherapy；Bone marrow suppression；Immune function influence

(收稿日期：2018-08-10)

Corresponding author：ZHANG Run-lian， E-mail： 109798530@qq.com

【中图分类号】R273

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.03.009

作者简介：张润莲(1974- )，女，本科，副主任医师。研究方向：中医肿瘤临床和针灸教学工作。E-mail： 109798530@qq.com