樱桃谷肉鸭大肠杆菌病PCR鉴定及治疗药物筛选与应用

黄银云++胡新岗++郭广富++徐婷婷

摘要：为给如皋地区养鸭合作社肉鸭养殖诊治大肠杆菌病提供依据，采用PCR技术鉴定长期困扰养鸭业疑似大肠杆菌病的病原，通过27种药敏制片试验筛选出适合当地的先锋霉素Ⅴ、先锋霉素Ⅵ、头孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B等6种高敏药物及头孢哌酮、头孢曲松、羧苄西林、氨苄西林等4种中敏药物，确定链霉素、卡那霉素、新霉素、强力霉素、氧氟沙星等17种抗菌药物不适于在该地区应用。并采用6种高敏药物分组，治疗病鸭均取得了良好的临床疗效。

关键词：樱桃谷鸭；大肠杆菌病；PCR；药敏试验；疗效

中图分类号： S858.32文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0241-03

收稿日期：2015-03-22

基金项目：江苏省高校“青蓝工程”资助。

作者简介：黄银云（1977—），女，江苏泰州人，硕士，副教授，主要从事动物疫病防控研究及动物医学专业教学工作。E-mail：gxh008@qq.com。随着集约化养鸭业的发展，大肠杆菌病已严重威胁到养鸭业的健康发展。大肠杆菌属于条件性致病菌，当由于各种应激刺激造成鸭体的免疫功能降低时，鸭群就会发生感染[1]。该病既可通过消化道感染，也可通过呼吸道感染，甚至可以通过种蛋垂直传播。肉鸭发病多见于10～30日龄，发病率和死亡率较高，临床常见肝周炎、气囊炎、心包炎和脑炎病变[1-2]。常见的发病原因包括鸭舍环境卫生差、空气污浊灰尘多、不重视消毒预防、引进带有大肠杆菌的鸭苗等。此外，由于养殖户缺乏科学给药知识，临床上频繁使用某些抗菌药物，导致地方性大肠杆菌耐药严重，治疗效果不佳，而抗菌药物虽然可以暂时控制疫情发展，但停药后常会复发，给鸭场造成了极大的损失[3]。江苏省如皋市某樱桃谷肉鸭养殖合作社长期受疑似大肠杆菌病困扰，笔者应用PCR技术鉴定该病病原，并通过药敏试验筛选了该合作社可用的敏感药物，并取得了很好的临床效果。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器设备Mikro200R冷冻高速离心机、JS-380A自动凝胶图像分析仪、PCR仪（PTC-200rev）、DYY-7C型电泳仪、DYCP-31DN琼脂糖水平电泳槽、恒温箱、微量移液器等。

1.1.2试剂麦康凯平板、伊红美兰平板、鲜血平板培养基，由江苏省动物流行病学研究中心制备提供；TSB培养基、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2、10×PCR buffer、100 bp DNALadder和6× DNA 凝胶载入染料（LoadingDye），均为上海生工生物工程有限公司产品，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.1病料选取如皋市某樱桃谷肉鸭养殖合作社疑似感染大肠杆菌新鲜病死鸭10羽，无菌采集肝脏、脾脏、心脏和大脑，-20 ℃保存备用。

1.1.2药敏试纸先锋霉素Ⅴ、先锋霉素Ⅵ、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢曲松、头孢氨苄、头孢他啶、红霉素、麦迪霉素、美满霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、万古霉素、多黏菌素B、氧氟沙星、羧苄西林、哌拉西林、氨苄西林、链霉素、卡那霉素、强力霉素、诺氟沙星、盐酸环丙沙星、庆大霉素、克林霉素、四环素、杆菌肽共计27种药敏纸片，购于杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3试验动物试验鸭为如皋市某养鸭合作社发生大肠杆菌病的600羽20日龄樱桃谷鸭。试验于2014年5月4日至6月9日进行，试验期间均按照该养鸭合作社的常规饲养管理办法进行日常饲养与管理，重视带鸭消毒。

1.2方法

1.2.1细菌分离及TSB培养基增菌无菌划线分离，将病料接种于鲜血平板培养基，置于37 ℃烛缸中培养24 h，观察菌落形态和溶血情况。经革兰氏染色镜检后，挑取目的菌落，利用TSB培养基增菌。同时接种于麦康凯、伊红美蓝培养基，37 ℃培养24 h，观察其生长特性。

1.2.2细菌DNA的提取细菌DNA提取采用热裂解法[4]。

1.2.3PCR检测细菌引物设计参照文献[5]。以提取的细菌DNA为模板进行PCR扩增，PCR采用50 μL反应体系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、上下游引物各1 μL、3 μL cDNA、Taq DNA聚合酶 1 μL，用灭菌超纯水补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳图谱，拍照记录结果。

1.2.4药敏试验将经过分离纯培养的菌株按KB纸片法进行药敏试验[6]，37 ℃温箱培养24 h，分别测量药敏纸片的抑菌圈直径的大小，结果按美国临床和实验室标准协会（CLSI）的标准判断（表1）。

1.2.5治疗设计将600羽病鸭随机分成6组，每组100羽。根据药敏试验结果，选择药物敏感性较好的6种药物进行治疗，对应的组别分别是先锋霉素Ⅴ组、先锋霉素Ⅵ组、头孢呋辛组、丁胺卡那霉素组、红霉素组、多黏菌素B组。治愈判定标准：临床症状基本消失，精神、饮食、粪便正常。观察疗效，统计治愈率，用统计学方法分析各组间疗效差异显著性。

2结果

2.1分离菌株的培养特性

目的菌为革兰氏染色阴性短小杆菌。鲜血平板培养的菌落灰白色，呈凸起圆形，光滑而湿润，无溶血；在麦康凯培养基上呈粉红色菌落；伊红美蓝平板上形成的菌落呈黑色且有金属光泽。

2.2PCR扩增结果

对病料进行PCR检测，得到大肠杆菌OmpA目的基因片段，片段大小为408 bp（图1），与预期的结果相符。确诊该养殖合作社肉鸭感染大肠杆菌病。

2.3药敏试验结果

试验结果见表1。在本试验病料采集地，鸭源大肠杆菌对先锋霉素Ⅴ、先锋霉素Ⅵ、头孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B等6种试验药物高敏，对头孢哌酮、头孢曲松、羧苄西林、氨苄西林等4种试验药物中敏，而对其他试验药物耐药。根据试验结果，高敏药物和中敏药物均可用于该群病鸭的治疗，以高敏药物为佳。

2.4治疗效果

由药物治疗试验结果（表2），采用经药敏试验选取的治疗药物，临床均能及时控制疫情并取得了较理想的治疗效果。先锋霉素类的先锋霉素Ⅴ组、先锋霉素Ⅵ组、头孢呋辛组之间治疗效果差异不显著（P>0.05）；丁胺卡那霉素组与先锋霉素类组比较差异不显著（P>0.05）；红霉素组与多黏菌素B组比较，差异显著（P<0.05），这2组与先锋霉素类组间比较差异亦显著（P<0.05）。

3分析与讨论

研究表明，鸭病原性大肠杆菌血清型复杂，不同地区的血清型存在差异[7]。此外，鸭大肠杆菌病与鸭疫里默氏杆菌病都是危害肉鸭养鸭业最重要的传染病，2种病的临床表现极为相似，诊断时容易混淆。这些都导致大肠杆菌病采用病原学诊断具有一定的困难。而PCR诊断具有方便、快捷、特异性强、诊断结果准的特点，为鸭大肠杆菌病的快速诊断、及时处理提供了准确可靠的依据[5]。

在如皋地区，肉鸭源大肠杆菌对先锋霉素Ⅴ、先锋霉素Ⅵ、头孢呋辛、丁胺卡那霉素、新霉素、多黏菌素B最为敏感，可能与这些药物在该地区临床应用频度小有关。头孢氨苄、头孢他啶 、链霉素、庆大霉素、强力霉素等药物可能由于广泛而长期应用，导致其耐药性也较为严重。本次药敏试验也表明，鸭源大肠杆菌的多重耐药性还是比较严重的，应给予足够重视。这也提醒养殖户一旦发现疫情，应立即向畜牧兽医部门求助，及时通过药敏试验选取有效治疗药物，以免错误用药贻误最佳治疗时机。在用药时要注意轮换、联合、交叉用药，尽量不给细菌产生耐药性的机会。

大肠杆菌作为条件性致病菌，对污染的环境适应性强，不重视鸭舍环境卫生，不进行鸭舍场地消毒，是该养鸭合作社肉鸭养殖中连续多批次发病的主要诱因。因此，实行引进鸭苗检疫、执行全进全出制度、严格遵守兽医卫生防疫制度、加强饲养管理、减少应激因素是养鸭业预防鸭大肠杆菌病的有效措施。

参考文献：

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