放疗在大肠癌中作用分子靶标的筛选

梁崟

300011天津市职业病防治院（天津市工人医院）放射科

放疗在大肠癌中作用分子靶标的筛选

梁崟

300011天津市职业病防治院（天津市工人医院）放射科

目的基于基因表达谱芯片，利用生物信息学方法，探索放疗在大肠癌治疗中的重要靶点。方法在GEO数据库中下载GSE15781基因表达谱数据，利用R编程语言得到放疗后大肠癌样本相对于未放疗大肠癌样本、未放疗大肠癌样本相对于未放疗正常大肠样本的差异表达基因。利用DAVID在线工具对差异表达基因进行功能富集分析，对于在两组差异表达基因中同时出现的部分，利用HPRD数据库构建它们的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。结果放疗后的大肠癌样本相对于未放疗的大肠癌样本存在702个差异表达基因；与未放疗的正常大肠组织相比，未放疗的大肠癌样本中存在126个差异表达基因。这些差异表达基因主要富集于细胞黏附、细胞增殖等与细胞生物活动及炎症相关的生物过程中；且这两组差异表达基因重合了16个基因，在它们的PPI网络中，PTGS2、SDCBP2等基因与其他基因联系较密切，可能是放疗的重要靶标基因。结论通过基因表达谱的分析，可能得到大肠癌放疗的重要靶标，这对其实验研究和临床治疗具有非常重要的意义。

表达谱；生物信息学；大肠癌；放疗

0 引言

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，主要包括结肠癌和直肠癌[1]。随着我国居民经济条件和人口结构等的变化，大肠癌的发病率和死亡率在逐年上升，且被确诊时大都属于中晚期[2]。以手术治疗为主，辅之以放疗，是当前主流的大肠癌治疗方式，且对于早期大肠癌，单纯的放疗即可根治[3]。因此，放疗越来越受到国内专家的重视。然而，大肠癌或其他癌症对放疗的敏感性受多种因素的影响，如低氧[4]、某些基因表达水平的变化[5]等。因此，探索影响大肠癌对放疗敏感性的生物标记，寻找放疗作用的分子靶标，将有助于提高放疗效率，改善患者预后。目前，已发现部分基因和通路能影响癌症对放疗的敏感性，如靶向Notch信号通路能克服癌症对放疗的抵抗[6]；Liao等[7]通过基因敲除结合流式细胞技术，发现在大肠癌中microRNA-32能通过靶向DAB2IP基因诱导癌细胞对放疗产生抗性。这些研究均为癌细胞对放疗抵抗机理的了解提供了重要靶标和线索，但要达到改善癌症放疗预后的目的，还需大量的研究来探索放疗敏感性靶标。本研究通过分析美国国家生物技术信息中心（NCBI）（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/）GEO数据库中的基因表达芯片数据，在比较大肠癌样本相对于正常样本的基因表达差异基础上，进行放疗前后大肠癌中基因表达谱的比较，能更有针对性地研究与癌症相关的基因对放疗的敏感性，并得到潜在的敏感基因，以有助于改善放疗后大肠癌的预后。

1 方法

1.1 基因表达谱数据的获取

首先从NCBI的GEO数据库中下载关于大肠癌放疗研究的基因表达谱数据，编号是GSE15781，由来自特罗姆瑟大学临床医学及分子医学研究所的Paulssen等提供[8]。该数据采用GPL2986平台（ABI Human Genome Survey Microarray Version 2），包括13个未经放疗的大肠癌样本和9个经过放疗的大肠癌样本，除此之外，还包括10个未经放疗的正常大肠癌组织和10个经过放疗的正常大肠组织。

1.2 芯片数据预处理

芯片数据预处理采用R语言的preprocessCore函数包进行分位数标准化，并把检测的信号值进行log2转换，作为基因表达值。

1.3 差异表达基因分析

基因差异表达分析基于R语言的limma函数包进行。对基因在不同样本间的表达值进行t检验和Benjamini-Hochberg（BH）校正，同时满足变化倍数（Fold change）＞2或＜0.5且校正P＜0.01的基因被选为差异表达基因。

1.4 基因功能富集分析

利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在线工具，对得到的差异表达基因进行功能富集分析。以DAVID中默认的基因集为背景基因，至少包含了5个基因且P＜0.05的基因本体（Gene Ontology，GO）terms和KEGG通路被认为是差异表达基因富集的功能。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建

对于在放疗后的大肠癌样本相对于未放疗的大肠癌样本以及未放疗的大肠癌样本相对于未放疗的正常大肠样本同时发生差异表达的基因，利用HPRD（http://www.hprd.org/）数据库筛选它们之间的相互作用，再利用Cytoscape软件对这些相互作用进行可视化，得到蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction,PPI）网络。

2 结果

2.1 标准化后芯片数据

在差异表达分析之前，先对芯片数据进行预处理，预处理结果见图1。由图可看出，标准化之后各样本之间所有基因的表达值范围基本一致，这说明芯片的标准化消除了系统偏差。

图1 预处理后每个样本中所有基因的表达值

2.2 差异表达基因

利用limma函数包对GSE15781数据集中的芯片数据进行差异表达分析，分别得到了放疗后的大肠癌样本相对于未放疗的大肠癌样本、放疗后的正常大肠组织相对于未放疗的正常大肠组织以及未放疗的大肠癌样本相对于未放疗的正常大肠样本的差异表达基因，3组差异表达基因中包含的上、下调基因个数见表1。

表1 从GSE15781中得到的3组差异表达基因中包含的上调和下调基因数

2.3 差异表达基因功能富集分析

利用DAVID在线工具，对放疗后大肠癌相对于未放疗大肠癌样本的702个差异表达基因和未放疗大肠癌相对于未放疗正常大肠组织的126个差异表达基因进行功能富集分析。发现这些差异表达基因主要与细胞结构、细胞黏附等生物过程相关，除此之外，与炎症和癌症发展等相关的功能和通路在这些基因中也是富集的。这两组差异表达基因富集的主要生物过程和通路见图2。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络

在放疗后大肠癌样本相对于未放疗大肠癌样本的差异表达基因与未放疗大肠癌样本相对于未放疗正常大肠组织的差异表达基因之间，得到了16个重合基因，这16个重合基因在这4组样本中的表达值热图见图3。同时利用HPRD数据库，构建了这些基因的PPI网络（图4）。

图2 两组差异表达基因涉及的主要生物过程和通路

图3 重合的差异表达基因在4组样本中的表达值热图

图4 重合差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络

3 讨论与结论

基因的差异表达在许多疾病的治疗中起着非常重要的作用[9-10]。在大肠癌中，某些基因的表达变化能影响细胞的增殖或凋亡，介导机体的免疫反应来影响患者对放疗的敏感性[11-12]。同时，放疗又可通过改变基因的表达，来起到治疗癌症的作用，故筛选出癌症放疗的作用靶标显得尤为重要。

本研究中的基因表达谱数据显示，放疗后的大肠癌相对于未放疗的大肠癌样本存在702个差异表达基因，而放疗后的正常大肠组织相对于未放疗的正常大肠组织却只有5个差异表达基因，这说明放疗对正常组织的影响非常小，却能改变大肠癌样本中许多基因的表达。这些差异表达基因主要富集于细胞黏附、细胞增殖和免疫、炎症反应等与癌症密切相关的生物过程。而在大肠癌中，细胞的凋亡更能直接影响患者对放疗的抵抗反应[13]，且对放疗敏感性高的大肠癌患者相对于敏感性低的大肠癌患者，有较高的瘤内免疫活性[14]，这进一步说明了免疫反应在放疗中的作用。

在实现某一生物过程或产生某种表型时，基因通常以整体的形式发挥作用，而不是单个基因。因此，在本研究中，对于在未放疗大肠癌相对于未放疗正常大肠样本和放疗后大肠癌相对于未放疗大肠癌同时发生差异表达的16个基因，笔者基于HPRD数据库构建了它们的PPI网络。在PPI网络中，PITX2与15个基因发生了相互作用，且由图3可知，PITX2在由正常大肠组织向大肠癌转变的过程中表达值升高，而在放疗后表达值降低，这说明PITX2可能是重要的大肠癌致癌基因。PITX2的染色体位置为4q25（4号染色体长臂，2区5带），由它编码的蛋白质作为一个转录因子，能调节胶原赖氨酰羟化酶基因的表达，该蛋白在生长激素细胞的终端分化中有非常重要的作用。在Hirose等[15]的研究中，PITX2也被证实在大肠癌中明显高表达，并与大肠癌的预后显著相关；此外，PITX2还被认为是食管鳞状细胞癌和非小细胞肺癌的重要放疗靶点[16-17]，因此PITX2也可能是大肠癌中放疗的重要分子靶标。类似的，ETV4基因在由正常大肠组织向大肠癌转变时表达值升高，而在放疗后表达值降低。ETV4的染色体位置为17q21.31，又名E1AF、PEA3、E1AF、PEAS3，其突变与多种癌症的发生密切相关，包括大肠癌[18]。作为一种蛋白质编码基因，ETV4的差异表达能促进大肠癌细胞的增殖和侵袭，被许多研究认为是大肠癌发病的重要分子靶标[19]，但却未在放疗中被研究过，ETV4可能是大肠癌中一个新的放疗分子靶标。

本研究通过分析GEO数据库中的基因表达谱数据集，筛选得到了大肠癌放疗后潜在的作用靶标，并探索了可能发生变化的生物过程，这将为大肠癌的治疗和研究提供一定的方向。然而，要确定这些分子靶标是否可靠，还需进一步的分子生物学实验的验证。

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Identification of molecular targets of radiotherapy in colorectal cancer

Liang Yin
Department of Radiology,Occupational Disease Prevention Hospital in Tianjin(Tianjin Hospital Workers),Tianjin 300011,China

ObjectiveTo explore the potential therapeutic targets of radiotherapy in colorectal cancer via bioinformatics analysis of gene expression microarray.MethodsThe gene expression dataset GSE15781 was downloaded from the GEO database.The differentially expressed genes in radiotherapy treated colorectal cancer samples compared with those without radiotherapy,as well as differentially expressed genes in colorectal cancer samples without radiotherapy compared with normal colorectal tissues without radiotherapy,were obtained by R programming.The DAVID database was used for the functional enrichment analysis of the differentially expressed genes.Besides,protein-protein interaction(PPI)network of the overlapped genes between the two groups of differentially expressed genes were constructed based on the HPRD database.ResultsA total of 702 differentially expressed genes were obtained for the radiotherapy treated colorectal cancer samples compared with the ones without radiotherapy.Besides,126 differentially expressed genes in colorectal cancer samples without radiotherapy compared with normal colorectal tissues without radiotherapy were identified.Biological processes that related to cell adhesion,cell proliferation,as well as inflammatory response were found to be enriched in those differentially expressed genes.Moreover,16 overlaps were found between the two groups of differentially expressed genes,and in the PPI network of the 16 overlapped genes,PTGS2 and SDCBP2,etc,were closely correlated with other genes,which might be the important therapeutic targets of radiotherapy.ConclusionsSome potential therapeutic targets of radiotherapy in colorectal cancer can be obtained by analysis of gene expression profiles,which may be very important for the study and treatment.

Gene expression profile;Bioinformatics;Colorectal cancer;Radiotherapy

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．01．007

2015-11-07）