载阿霉素聚合物纳米粒的制备、表征与体内外性能研究

胡春艳 陈卓 务圣洁 樊帆 秦玉 王海 朱敦皖 张琳华

300192天津，中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室

载阿霉素聚合物纳米粒的制备、表征与体内外性能研究

胡春艳 陈卓 务圣洁 樊帆 秦玉 王海 朱敦皖 张琳华

300192天津，中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室

目的 以两亲性三嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯（PCL-b-PEG-b-PCL）为载体材料，制备包载抗肿瘤药物阿霉素（DOX）的聚合物纳米粒，并对其进行体内外性能研究。方法 以PCL-b-PEG-b-PCL作为载体材料，通过薄膜水化超声分散法制备出载DOX的聚合物纳米粒，并对其形态、粒径及其分布、载药量及包封率等理化性能进行表征。采用MTS法研究载DOX聚合物纳米粒对EMT6乳腺癌细胞的细胞毒性，激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察EMT6细胞对纳米粒的细胞吞噬，离体脏器荧光成像研究纳米粒在荷EMT6乳腺癌小鼠的组织分布。结果 通过薄膜水化超声分散法成功制备出载DOX聚合物纳米粒，透射电镜和扫描电镜结果表明，该纳米粒呈球形，大小均匀，具有明显的核壳结构。粒度分析表明，载DOX聚合物纳米粒的平均粒径为130.8 nm，且粒径分布较窄（多分散系数为0.200）。DOX在聚合物纳米粒中的包封率和载药量分别为（86.71±2.05）%和（8.71±0.57）%。细胞毒性研究发现，空白纳米粒对EMT6细胞无毒性，而载入DOX后，DOX-NPs的细胞毒性具有时间和剂量依赖性；在DOX质量浓度较高（20 μg/ml和40 μg/ml）和孵育时间较长（72 h）时，载DOX聚合物纳米粒与游离DOX的细胞毒性相当，差异无统计学意义（P＞0.05）。CLSM观察发现，EMT6乳腺癌细胞与载DOX聚合物纳米粒共同孵育后，DOX的荧光在细胞质和细胞核中均有分布，但与游离DOX共同孵育后，DOX的红色荧光主要出现在细胞核中。离体脏器荧光成像研究表明，分别对荷EMT6乳腺癌小鼠尾静脉注射载DOX聚合物纳米粒及游离DOX后，载DOX聚合物纳米粒可通过增强渗透和滞留效应（EPR）在肿瘤部位有效聚集。结论 载DOX聚合物纳米粒具有适合静脉注射的粒径、高载药量和包封率及良好的被动靶向特性，是一种在肿瘤治疗中具有潜在应用前景的纳米药物递送系统。

聚合物纳米粒； 被动靶向； 药物递送； 乳腺癌； 阿霉素

Fund program:National Natural Science Foundation of China(81571793,51373199,81671806);Tianjin Natural Science Foundation(15JCZDJC38300);Basic Scientific Research Funds Programs in National Nonprofit Scientific Research Institutes(2016ZX310095,2016ZX310098)

0 引 言

阿霉素（doxorubicin,DOX）是一种蒽环类抗肿瘤药物，对乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌及急性淋巴细胞白血病具有良好的治疗效果[1-2]。然而，半衰期短和心脏毒性等缺点限制了其临床应用。为了提高DOX的临床治疗效果并降低其严重的毒副作用，新型DOX药物递送系统如脂质体[3-4]、聚合物纳米粒[5-7]等受到了广泛关注。

近十年来，由两亲性嵌段共聚物自组装形成的聚合物纳米粒在药物递送载体方面引起了研究人员的广泛兴趣[8-9]。聚合物纳米粒具有核壳结构，在选择性溶剂中，溶解性差的链段形成胶束的内核，溶解性好的链段形成胶束的外壳。作为一种高效的药物载体，聚合物胶束的疏水性内核可包载疏水性药物，降低其对人体的毒副作用；亲水性外壳可提高药物的稳定性，并影响胶束的体内外行为，并可通过增强渗透和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）在肿瘤部位不断蓄积[10-11]。

聚合物纳米粒通常由两亲性嵌段共聚物聚己二醇（polyethylene glycol,PEG）-R组成，R代表疏水性的可生物降解组分如聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚己内酯（polycaprolactone, PCL）及其共聚物[12]。在水溶液中形成聚合物纳米粒的两亲性共聚物类型有A-B两嵌段共聚物及A-BA和B-A-B三嵌段共聚物，其中A和B分别代表亲水嵌段和疏水嵌段。由A-B两嵌段和A-B-A三嵌段形成的纳米粒表面是“刷状”亲水性外壳结构，而BA-B三嵌段共聚物形成的纳米粒表面是“花状”亲水性外壳结构[13]。与具有“刷状”亲水性外壳的纳米粒相比，“花状”亲水性外壳的纳米粒中亲水嵌段的末端锚定在核壳交界处，封闭的表面亲水结构使其具有更好的稳定性和更高的药物包封率，可更有效地阻止体内调理素的结合，从而具有更好的长循环特性[14-15]。

PEG和PCL均为已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的具有良好生物相容性和可生物降解的材料，在生物医药和药物递送领域具有广泛的应用前景。两亲性PCL/PEG可通过改变分子质量和疏水嵌段与亲水嵌段比例来形成微粒/纳米粒或温敏水凝胶。PCL-PEG-PCL共聚物可制备出具有“花状”表面结构的纳米粒，包载药物后所形成的载药纳米粒具有良好的稳定性和长循环特性，是一种良好的可注射用药物递送载体[16-18]。本研究拟制备基于PCL-PEG-PCL共聚物的“花状”载DOX聚合物纳米粒，使其适合静脉注射，并可利用EPR将抗肿瘤药物被动靶向递送至肿瘤部位。采用薄膜水化超声分散法制备载DOX纳米粒并对其进行形貌、粒径及其分布、载药量和包封率等理化性能表征，研究其对EMT6乳腺癌细胞的细胞毒性和细胞吞噬性能，并通过对荷EMT6乳腺癌小鼠的主要器官和肿瘤进行体外成像考察DOX的荧光强弱及组织分布，以评价该药物递送系统的被动靶向效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

ε-己内酯（ε-CL）、PEG（分子质量为8 000 u）（美国Sigma-Aldrich公司），盐酸阿霉素（DOX·HCl）（大连美仑生物科技公司），CellTiter 96®Aqueous单溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS）（美国Promega公司），微丝绿色荧光蛋白（Actin-trackerGreen）、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole）（DAPI）溶液（上海碧云天生物技术有限公司），所有的细胞培养基和其他组分（美国Gibco公司）。BALB/c雌性裸鼠，体质量为18～22 g，购自天津医科大学动物实验中心。

SpectraMax Plus384酶标仪（美国 Molecular Devices公司），Sigma 2-16K离心机（德国Sigma公司），LSM710激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy,CLSM）（德国Carl Zeiss公司），VCX-130PB小探头超声器（美国Sonics&Materials公司），Sirion 200扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）、Tecnai-F20透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）（荷兰 FEI公司），Nano-ZS90粒度分析仪（英国Malvern仪器有限公司），CRIMaestro体内成像系统（美国CRI公司）。

1.2 方法

1.2.1 载DOX聚合物纳米粒的制备

载DOX聚合物纳米粒通过之前报道的薄膜水化超声分散法[19]制得，整个制备过程在避光条件下进行。DOX·HCl用甲醇溶解后与三乙胺混合，室温下磁力搅拌过夜；PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物用二氯甲烷溶解后加入含有DOX的甲醇溶液，通过旋转蒸发去除有机溶剂获得DOX/共聚物的薄膜层；薄膜层用水浴预热形成透明的凝胶状样品，加入去离子水后水化一定时间；混合物在冰浴下用小探头超声器超声10 min获得澄清的纳米粒混悬液；最后将该混悬液23 000 r/min离心30 min，离心3次以去除未包载的DOX。

1.2.2 载DOX聚合物纳米粒的表征

纳米粒的形态结构通过SEM和TEM表征。载药纳米粒的粒径和多分散系数通过粒度分析仪测定。纳米粒中包载的DOX含量采用紫外/可见光吸收光谱法在480 nm下测得，药物的载药量和包封率分别通过以下公式计算

1.2.3 体外细胞毒性实验

通过CellTiter 96®Aqueous单溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS）检测载DOX聚合物纳米粒对EMT6乳腺癌细胞的细胞毒性。用0.25%胰蛋白酶消化单层EMT6乳腺癌细胞，再用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基配成单细胞悬液；以每孔约5000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μl，于37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h；用200 μl含游离DOX或载DOX聚合物纳米粒的培养基替换（DOX的质量浓度分别为0.5、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml），孵育24、48、72 h；弃掉培养基，每孔加入80 μl新鲜培养基后再加入20 μl MTS试剂，孵育3 h后用酶标仪于490 nm处测定吸光度（OD）值。按下式计算细胞存活率，并绘制细胞生长抑制曲线。

1.2.4 体外细胞吞噬实验

利用DOX具有自发荧光，采用CLSM观察EMT6乳腺癌细胞对游离DOX及载DOX聚合物纳米粒的吞噬。将EMT6乳腺癌细胞接种于共聚焦培养皿中，于37℃培养箱中培养24 h；细胞贴壁生长后吸弃培养基，加入用培养基稀释的游离DOX及载DOX聚合物纳米粒（DOX的质量浓度均为20 μg/ml），孵育24 h后弃掉培养基，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）洗涤3次；加入免疫染色固定液固定10 min，免疫染色洗涤液洗涤3次；然后用微丝绿色荧光蛋白（Actin-tracker Green）染色1 h；用免疫染色洗涤液洗涤后加入DAPI溶液染细胞核5 min，PBS洗涤3次；最后用CLSM观察细胞吞噬情况。

1.2.5 荷瘤小鼠体内分布研究

将EMT6细胞（1×106个）皮下注射接种于BALB/c小鼠腋下，等肿瘤大小达到100 mm3即可进行实验。对荷瘤小鼠分别尾静脉注射游离DOX和载DOX聚合物纳米粒，DOX剂量均为10 mg/kg。于注射后4 h和24 h处死小鼠，收集肿瘤和主要器官（心、肝、脾、肺、肾），用PBS冲洗。脏器用CRI Maestro体内成像系统在激发波长523 nm和发射波长560 nm处成像，图像用CRI Maestro分析软件分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS10.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（±s）表示，样本间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 载DOX聚合物纳米粒的表征

本研究用三乙胺去除DOX·HCl的盐酸使其转化为疏水性，并通过薄膜水化超声分散法成功制备出疏水性内核载疏水性药物DOX的聚合物纳米粒。如图1A所示，制备的载DOX聚合物纳米粒悬液为红色均匀分散体系。图1B为载DOX聚合物纳米粒的示意图，亲油性的PCL链段包裹或缠绕DOX依靠疏水作用将DOX载入聚合物胶束的疏水性内核中，亲水性的PEG链段两端被锚定在核壳交界处，并向水相伸展形成亲水性壳层，从而使载药聚合物纳米粒能很好地分散于水相并具有长循环特性。SEM图表明载药纳米粒具有粗糙表面的均一球形结构（图1C）；TEM图表明所制备的载DOX聚合物纳米粒具有明显的核壳结构（图1D），亲水性PEG链段包裹在疏水性内核外围形成具有明显冠状结构表面。由PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物形成的聚合物纳米粒，PEG的两端被锚定在核壳交界处，形成的“花状”亲水性结构可更有效地阻止体内调理素的结合，使纳米粒更加稳定，具有更好的长循环特性[14-15]。用粒度分析仪对载DOX聚合物纳米粒进行粒径及其分布测定。如图1E所示，载药量为8.72%的载DOX聚合物纳米粒的平均粒径为130.8nm，且有较窄的粒径分布（多分散系数为0.200）。载DOX聚合物纳米粒的纳米尺寸及窄粒径分布利于其进行肿瘤的被动靶向递送。

2.2 载DOX聚合物纳米粒的体外细胞毒性研究

为了研究释放的DOX是否仍具有药理活性，并评价载药纳米粒的细胞毒性，本研究采用MTS法研究载DOX聚合物纳米粒、游离DOX及空白聚合物纳米粒对EMT6乳腺癌细胞的细胞毒性。细胞培养基中DOX的质量浓度为0.5～40 μg/ml，各组对EMT6乳腺癌细胞的生长抑制曲线如图2所示。空白聚合物纳米粒无明显的细胞毒性，故可作为药物载体，而游离DOX和载DOX聚合物纳米粒的细胞毒性则具有时间和剂量依赖性。与载DOX聚合物纳米粒相比，游离DOX在与EMT6乳腺癌细胞孵育24 h和48 h后对肿瘤细胞具有更高的细胞毒性（P＜0.05）。然而，孵育72 h后显示在DOX高质量浓度（20 μg/ml和40 μg/ml）时，游离DOX和载DOX聚合物纳米粒的细胞毒性差异无统计学意义（P＞0.05）。这可能是由于肿瘤细胞对游离DOX和载DOX聚合物纳米粒具有不同的摄取机制。在细胞培养过程中，大多数游离DOX可通过被动扩散方式快速进入细胞核发挥作用，而载药纳米粒主要通过胞吞方式进入肿瘤细胞，且待药物分子从纳米粒中释放出来才发挥抗肿瘤活性。因此，这就需要足够时间使载DOX聚合物纳米粒显示其细胞毒性。

2.3 体外细胞摄取

为研究细胞对载DOX聚合物纳米粒的摄取及其在细胞内的分布，用CLSM观察游离DOX和载DOX聚合物纳米粒与EMT6乳腺癌细胞共同孵育24 h后的细胞吞噬情况。细胞骨架用微丝荧光蛋白染色，细胞核用DAPI染色。结果如图3所示，载DOX聚合物纳米粒的DOX荧光（红色）分布于细胞骨架、细胞质和细胞核，而游离DOX的红色荧光主要分布于细胞核中。同时，由于细胞对游离DOX和载DOX聚合物纳米粒的摄取方式不同，游离DOX通过扩散方式能快速穿过细胞膜被转运进细胞核[20]，而载DOX聚合物纳米粒通过肿瘤细胞的胞吞作用入胞，因此与细胞共同孵育后，游离DOX在细胞核内显示出更强的DOX荧光。DOX是在DNA合成过程中发挥细胞毒性作用，当DOX包载在纳米粒中后通过胞吞作用进入细胞，并最终释放DOX进入细胞核中发挥作用。

2.4 荷瘤小鼠体内分布研究

采用CRI Maestro体内成像系统分析尾静脉给药后载DOX聚合物纳米粒和游离DOX在组织脏器中的分布。对荷EMT6乳腺癌小鼠分别尾静脉注射载DOX聚合物纳米粒和游离DOX（10 mg/kg）后，于4 h和24 h处死小鼠，分离主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤用于体外DOX荧光成像，阴性对照组尾静脉注射生理盐水。如图4所示，游离DOX组注射后4 h在肾和肝发现强烈的DOX荧光，且随着时间延长这些器官的荧光逐渐变弱，表明DOX被肾和肝代谢而快速从体内排出[21]；载DOX聚合物纳米粒组注射后4 h在肝脏首先发现强烈的DOX荧光；与游离DOX组相比，载DOX聚合物纳米粒组在注射后24 h肿瘤部位的DOX分布及积蓄明显增强，这与之前报道的具有小粒径（70～200 nm）的纳米粒会通过EPR在肿瘤部位选择性积累一致[22-23]。研究表明，载药聚合物纳米粒可明显提高药物稳定性，延长血液循环时间，并通过EPR有效地将药物富集于肿瘤部位。

3 结论

本研究通过薄膜水化超声分散法成功制备了基于PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物的载DOX聚合物纳米粒。获得的载DOX聚合物纳米粒具有明显的核壳结构、适合静脉注射的粒径和高包封率。体外细胞毒性研究表明，具有高质量浓度的载DOX聚物合纳米粒与EMT6乳腺癌细胞孵育长时间（72 h）所产生的细胞毒性与游离DOX（相同时间和相同DOX质量浓度）产生的细胞毒性差异无统计学意义（P＞0.05）。体外细胞摄取实验结果表明，当用载DOX聚物合纳米粒与EMT6乳腺癌细胞共同孵育后，DOX荧光在细胞质和细胞核中均有分布，且经长时间孵育后核中荧光强度比细胞质中要高，表明纳米粒先摄取入胞再释放DOX入核。体外成像分布结果表明，载DOX聚物合纳米粒对肿瘤组织渗透能力比正常组织强，且与游离DOX相比，载DOX聚物合纳米粒在肿瘤组织的DOX积蓄量更多。综上所述，本研究制备的载DOX聚合物纳米粒有望成为一种新型的抗肿瘤药物纳米递送载体。

利益冲突 无

（图1～4见插页4-7、4-8）

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Preparation,characterization,in vitro and in vivo evaluation ofdoxorubicin-loaded polymeric nanoparticles

Hu Chunyan,Chen Zhuo,Wu Shengjie,Fan Fan,Qin Yu,Wang Hai,Zhu Dunwan,Zhang Linhua

Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials,Tianjin 300192,China

Zhang Linhua,Email:zlhbme@163.com

Objective To prepare and evaluate the polymeric nanoparticles based on PCL-PEG-PCL amphiphilic triblock copolymers for doxorubicin delivery against breast cancer.Methods PCL-PEG-PCL amphiphilic triblock copolymers were used to encapsulate doxorubicin by thin-film hydration and an ultrasonic dispersion method.The prepared DOX-loaded polymeric nanoparticles were characterized in terms of morphology, particle size and size distribution,drug loading content and encapsulation efficiency.In vitro cytotoxicity against EMT6 cell line was assessed by MTS assay.Confocal laser scanning microscopy(CLSM)was used to evaluate the cellular uptake of DOX-loaded polymeric nanoparticles.Ex vivo DOX fluorescence imaging of the isolated major organs and tumors in EMT6 tumor-bearing mice was observed.Results The DOX-loaded polymeric nanoparticles were successfully prepared by thin-film hydration and ultrasonic dispersion method.Transmission electron microscope and scanning electron microscope verified that the DOX-loaded polymeric nanoparticles were homogeneous spherical shapes with apparent core-shell morphology.The average particle size of the DOX-loaded polymeric nanoparticles was 130.8 nm with a narrow size distribution(polydispersity index was 0.200).DOX was entrapped in the polymeric nanoparticles with encapsulation efficiency and loading content of(86.71±2.05)%and(8.72±0.57)%,respectively.In vitro cytotoxicity assay against EMT6 cells demonstrated that the blank nanoparticles exhibited no cytotoxicity,while the cytotoxic effect of DOX-loaded polymeric nanoparticles gradually approached that of free DOX when increasing the concentration and the incubation time.CLSM results showed that the DOX fluorescence was distributed both in the cytoplasm and nucleus for DOX-loaded polymeric nanoparticles treated cells,while the red fluorescence was observed mostly in the nucleus for free DOX treated cells.Furthermore,ex vivo DOX fluorescence imaging revealed that DOX-loaded polymeric nanoparticles had highly efficient targeting and accumulation at the implanted site of an EMT6 xenograft tumor in vivo through enhanced permeability and retention effect(EPR).Conclusions The prepared DOX-loaded polymeric nanoparticles showed satisfactory size and narrow size distribution，high encapsulation efficiency and drug loading content,efficient passive targeting via EPR.These results suggest that the DOX-loaded polymeric nanoparticles might have the potential to be developed as a nano-drug delivery system for cancer chemotherapy.

Polymeric nanoparticles;Passive targeting;Drug delivery;Breast cancer;Doxorubicin

张琳华，Email:zlhbme@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．003

国家自然科学基金面上项目（81571793，51373199，81671806）；天津市自然科学基金重点项目（15JCZDJC38300）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（2016ZX310095，2016ZX310098）

2016-05-16）