3D打印气管补片细胞相容性和生物力学性能研究

王尧 单一波 史宏灿 杨俊峰 范懿魏

225001扬州大学临床医学院胸心外科，江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，扬州大学转化医学中心

3D打印气管补片细胞相容性和生物力学性能研究

王尧 单一波 史宏灿 杨俊峰 范懿魏

225001扬州大学临床医学院胸心外科，江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，扬州大学转化医学中心

目的 研究3D打印气管补片的生物力学性能及其与骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生物相容性。方法 从幼年新西兰大白兔胫骨平台抽取骨髓，通过全骨髓培养及贴壁纯化法获取BMSCs进行培养和传代。对3D打印气管补片进行生物力学测试；同时将其与BMSCs共培养后进行细胞形态观察，并用磺酰罗丹明B（SRB）比色法测定细胞增殖活性。结果 3D打印气管补片具有良好的生物力学性能；其与BMSCs共培养后细胞形态正常，贴壁生长良好，且SRB比色法显示细胞增殖良好。结论 3D打印气管补片具备良好的生物力学性能和生物相容性，是一种具有开发潜力的生物材料，可用于组织工程气管的体外构建。

3D打印气管补片； 生物力学； 生物相容性； 组织工程气管

Fund program:National Natural Science Foundation of China(81170014,81370118);High-end Talent Support Program of Yangzhou University(201431);Research and Innovation Programme Fund of Colleges and Universities in Jiangsu Province(KYLX15_1388)

0 引言

气管病变可由肿瘤、外伤、感染及先天性疾病等引起，切除病变段气管并行端端吻合是治疗的金标准。但当气管病变长度超过成人气管长度的1/2或小儿气管长度的1/3时，只有植入气管替代物才是最可行的方法[1-2]。气管替代物的主要来源有同种异体组织、自体组织、生物材料及组织工程假体；然而，大量动物实验结果显示，由于移植后替代物不能形成有效的上皮化和血管化及出现感染、坏死、管腔堵塞等情况，结果导致移植失败[3]。3D打印技术的发展为解决气管替代物的再上皮化和再血管化问题提供了新思路。

Schantz等[4]以聚己内酯（polycaprolactone，PCL）为原料，利用溶融沉积成型（fused deposition modeling，FDM）技术制备了骨软骨复合支架，并将成骨细胞与软骨细胞分别种植于支架的两部分。数周后在成骨细胞种植区测出较高的骨钙，而软骨细胞种植区测出了较高的碱性磷酸酶，表明该支架有望用于骨软骨修复方面。Chang等[5]以新西兰兔为实验对象，将兔的气管开1 cm×1 cm的窗口，然后用种植骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的3D PCL补片修补气管缺口。术后第4周和第8周，经CT、纤维支气管镜和组织学分析等检查发现，重建的气管形状和功能正常，未出现任何的免疫排斥反应。本研究旨在以PCL为材料，通过3D打印技术打印出气管补片并研究其细胞相容性和生物力学性能，从而寻求合适的组织工程气管支架材料。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

实验动物购自扬州大学医学院实验动物中心，健康3周龄清洁级新西兰兔1只，雌性，体质量为1.5 kg，用来抽取BMSCs；健康4周龄清洁级新西兰兔6只，体质量为2.5～3.0 kg，雌雄不限，用于生物力学测试。

聚全氟乙丙烯、聚氯乙烯（无锡美生医疗器械有限公司），DMEM-F12培养基（美国HyClone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）、青霉素、链霉素、两性霉素B溶液（生工生物工程（上海）股份有限公司），吲哚美辛、地塞米松、黄嘌呤、胰岛素、磺酰罗丹明B（sulforhodamine B,SRB）、三氯醋酸（美国Sigma-Aldrich公司），胶原蛋白（康宁生命科学（吴江）有限公司），鼠抗兔抗CD44-PE、CD34-PE（北京博奥森生物技术有限公司）。

超净工作台（上海上净净化设备有限公司），CKX41倒置光学显微镜（日本Nikon公司），RS232恒温培养箱、Labofuge 400R离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），S4800场发射扫描电子显微镜（日本Hitachi公司），3367万能拉伸试验机（美国Instron公司），Epoch酶标仪（美国BioTek公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的获取与培养

抽取盐酸赛拉嗪注射液2 ml麻醉新西兰大白兔，固定、备皮、消毒、铺单。用18号骨髓穿刺针于左右胫骨平台处进行穿刺，然后用含有肝素的5 ml注射器抽取骨髓约2 ml。在洁净工作台中，将骨髓和肝素钠的混合液移入15 ml离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清；加PBS混匀后再1 000 r/min离心5 min，弃上清；加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基5 ml进行重悬，接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。此后，每隔48小时进行换液至传代，并通过贴壁筛选法去除未贴壁的细胞。待培养皿内的细胞生长接近80%融合时，进行传代。弃上清，PBS冲洗2次，滴加质量浓度为2.5 g/L的胰酶1 ml，2 min后镜下见细胞回缩变圆，立即加入培养基终止消化，吹打混匀；500 r/min离心5 min，弃上清，加入新鲜的含体积分数为10%胎牛血清的DEME-F12培养基重悬细胞，以1∶2比例传代至培养皿中。之后每隔48小时进行换液并观察细胞生长情况，直至培养皿中细胞达80%融合后进行传代。将经过灭菌的玻片置于无菌培养皿内，取第3代细胞悬液用吸管滴加几滴于玻片上，盖好后置于恒温箱中孵育12 h后取出玻片进行免疫荧光鉴定。

1.2.2 BMSCs的鉴定

（一）免疫荧光检测

将已制好的细胞爬片，用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定90 min，PBS冲洗3次，2 min/次；再加入体积分数为0.5%的曲拉通X-100（TritonX-100）37℃孵育20 min，PBS冲洗2次，5 min/次；然后滴加质量浓度为10 g/L的牛血清白蛋白37℃孵育30 min，除去多余液体；直接滴加含荧光素的鼠抗兔抗体（抗CD34-PE、抗CD44-PE），4℃过夜，PBS冲洗2次，2 min/次，最后留少量PBS观片。

（二）成脂诱导

将第3代BMSCs接种到培养皿中，培养至80%融合后，改用成脂细胞培养基进行培养，每2天进行换液；10 d后将细胞用PBS冲洗3次，5 min/次，用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定5 min，PBS冲洗3次；加油红O染色5 min，蒸馏水冲洗后于倒置光学显微镜下观察拍照。

1.2.3 3D打印气管补片的制备

3D打印气管补片由河南郑州创世纪3D打印公司制作。具体过程如下：通过建模软件犀牛5.0画出尺寸为10 mm×10 mm的三维实体框，导出stl格式文件；再将stl格式的三维数据文件导入打印机切片软件Cura 15.02.1，设置层厚为0.15 mm，填充65%，壁厚为0.8 mm，打印机喷头温度为120℃。打印总时长约50 min。

1.2.4 扫描电镜观察

将3D打印气管补片喷金后用扫描电镜观察分析。

1.2.5 3D打印气管补片的生物相容性检测

（一）细胞形态观察

设空白对照组、聚全氟乙丙烯组（阴性对照组）、3D打印气管补片组（实验组）和聚氯乙烯组（阳性对照组），每组设5个平行样本。将受试材料置于培养皿中，加入1ml浓度为1.0×105/ml的第3代BMSCs悬液，再加入1 ml新鲜培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。培养过程中定时通过倒置显微镜观察受试材料表面及边缘细胞的形态及生长状态，并根据表1进行毒性分级。（二）SRB比色法

表1 细胞形态与毒性分级标准

设空白对照组、聚全氟乙丙烯组（阴性对照组）、3D打印气管补片组（实验组）和聚氯乙烯组（阳性对照组）。按浸渍介质体积∶试样表面积为10 ml∶1 cm2制备样本浸渍液，浸渍介质为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，于37℃培养箱中培育24 h后灭菌备用。取96孔培养板，每孔加入100 μl浓度为1.0×105/ml的BMSCs悬液进行培养；24 h后，每孔加入100 μl样本浸渍液，于培养箱中分别培养1、3、5、7、9 d；吸弃上清液，每孔加入100 μl体积分数为10%的三氯醋酸，置于4℃冰箱1 h，自来水冲洗5次，自然晾干；每孔加入40 μl质量分数为0.4%的SRB，放于培养箱中30 min后，用体积分数为1%的醋酸漂洗4次，自然晾干；每孔加150 μl 10 mmol/L、pH 10.5的Tris碱，震荡20 min使紫色物充分溶解；最后采用酶标仪测定570 nm处各孔的吸光度（OD）值，并以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.6 生物力学测试

用游标卡尺测量各样本的长度、厚度及宽度。用万能拉伸试验机测试各样本的基质张力性能：将样本固定于万能拉伸试验机，给予1 N的初始负荷，室温下以30 mm/min的恒定速率开始检测，实时记录组织负荷及伸长率，判断样本最大力、弹性模量及组织变形情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs的培养与传代

由图1可知，培养48h后BMSCs贴壁，成簇生长，形态不一，多呈梭形（图1A）；6 d后BMSCs集落形成，细胞形态多呈梭形、多角形（图1B）；8d后BMSCs单层形成，融合达80%（图1C）；同时，第3代BMSCs中扁平细胞数量所占比例有所增加（图1D）。

2.2 BMSCs的鉴定

2.2.1 成脂诱导

成脂诱导实验结果如图2所示，成脂诱导10 d后细胞体积明显增大，油红O染色成鲜红色（图2A中箭头所示）；而阴性对照组油红O染色则未显示鲜红色（图2B）。

2.2.2 细胞免疫荧光

图4 3D打印气管补片的结构观察

细胞免疫荧光检测发现，标记CD44-PE的第3代BMSCs呈现出的绿色荧光遍及整个细胞表面（图3A）；而标记CD34-PE的第3代BMSCs呈棕褐色，无绿色荧光（图3B）。提示该细胞CD44抗原表达阳性，CD34抗原表达阴性。

2.3 3D打印气管补片的结构观察

3D打印气管补片的宏观结构如图4A所示；图4B、4C为3D打印气管补片超微结构的扫描电镜图，表明3D打印气管补片拥有适宜的孔隙率，其孔径为300～500μm。

2.4 生物力学性能测试

由表2可知，3D打印气管补片的最大应力及弹性模量明显优于原生气管补片，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而两种气管补片的长度、宽度和厚度间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 3D打印气管补片的体外生物相容性检测

2.5.1 细胞形态观察

3D打印气管补片组的BMSCs形态在1～7 d均正常，细胞贴壁生长良好，与聚全氟乙丙烯组无明显差异；而聚氧乙烯组中大量细胞死亡，细胞变大变圆，其内可见许多空泡，胞核固缩，基本不贴壁生长。（图5）

2.5.2 SRB比色结果

如图6所示，3D打印气管补片组与空白对照组、聚全氟乙丙烯组的细胞增殖曲线很接近，1～7 d呈不断上升趋势，7 d后由于细胞自身衰老死亡开始呈下降趋势，3组相同时间点OD值间差异均无统计学意义（P＞0.05）；而聚氯乙烯组的细胞增殖曲线随着时间延长呈下降趋势，到7 d左右细胞已基本死亡，与3D打印气管补片组相同时间点（1 d除外）的OD值比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 原生气管补片与3D打印气管补片形态学与机械性能指标（±s，n=6）

表2 原生气管补片与3D打印气管补片形态学与机械性能指标（±s，n=6）

注：与原生气管补片比较，aP＜0.05

机械性能指标长度（mm） 宽度（mm） 厚度（mm） 最大应力（N） 弹性模量（MPa）原生气管补片 50.23±0.31 11.50±0.46 0.83±0.06 6.46±0.92 1.62±0.13 3D打印气管补片 50.33±0.19 11.70±0.17 1.13±0.04 58.16±2.78a 93.27±7.83a样品 形态学指标

图6 细胞增殖曲线

3 讨论与结论

3D打印技术[6]是指采用三维喷墨打印技术，通过分层加工与叠加成形相结合的方法，逐层打印增加材料来生成3D实体，达到与激光成型等其他3D模型制造技术相同的3D真实物体的数字制造技术。与传统的组织工程学相比，3D打印技术[7]具有精度高、构建速度快、可按需制造以满足个体化医学治疗的需求、排斥反应低等优势。因此，通过3D打印技术制备气管补片是可行的。理想的生物支架应具有良好的生物相容性，能以合适的速度自然降解和吸收，还能为种植细胞提供诱导分化的微环境[8]。PCL[9]有着较好的生物兼容性、出色的机械强度和耐久性，且热塑性良好、易加工成型、熔点低，使得PCL被广泛应用于生物组织工程领域。

3D打印技术是近年来发展的新兴技术，通过该技术打印出来的气管补片是否具有出色的机械性能及生物相容性，需要通过实验来检验。组织工程气管支架材料必须具有一定强度的机械性能。因此，可通过对3D打印气管补片进行生物力学测试，以合理、准确地评估其生物力学性能，从而实现组织工程气管力学性能的可预测性。实验结果显示，3D打印气管补片的机械性能明显优于原生气管补片，完全达到组织工程气管支架材料的要求。

所有的生物材料都必须通过实验检测其是否具有细胞毒性[10]，而将其与体外细胞共培养是最常用、最快速及最灵敏的方法[11]。细胞在材料上的黏附是细胞进一步生长和分化的基础，也是衡量材料生物相容性的重要指标[12]。当细胞接触到有毒生物材料时，其形态或增殖状态会发生改变，还可观察细胞在材料表面的黏附生长情况，这些都为评估生物材料的生物相容性提供了可靠依据。本研究将3D打印气管补片与BMSCs共培养后，通过观察细胞形态及SRB比色法来评估生物材料的生物相容性。结果显示，3D打印气管补片组细胞形态在1～7 d均正常，细胞贴壁生长良好，与空白对照组及聚全氟乙丙烯组无明显差异；而聚氯乙烯组中大量细胞死亡，细胞变大变圆，其内可见许多空泡，胞核固缩，基本不贴壁生长。同时，SRB比色法结果表明，3D打印气管补片组的BMSCs增殖曲线与空白对照组及聚全氟乙丙烯组基本一致，随着时间延长呈不断上升趋势；而聚氯乙烯组的细胞增殖曲线则随着时间延长呈下降趋势，到7 d左右细胞已基本死亡。充分证实了3D打印气管补片无细胞毒性，具有良好的细胞生物相容性。

本研究通过对3D打印气管补片生物力学性能和生物相容性的研究，证实了3D打印气管补片具有较强的机械性能和良好的生物相容性，是一种具有开发利用潜力的生物材料；同时，也为下一步的动物体内实验提供了实验依据。

利益冲突 无

（图1、2见插页4-5，图3、5见插页4-6）

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Cellular biocompatibility and biomechanical properties of 3D printed tracheal graft

Wang Yao,Shan Yibo, Shi Hongcan,Yang Junfeng,Fan Yiwei

Department of Cardiothoracic Surgery,Medical College of Yangzhou University;Key Laboratory of Integrative Medicine in Geriatrics Control of Jiangsu Province;Center of Translational Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225001,China

Shi Hongcan,Email:shihongcan@hotmail.com

Objective To prepare 3D printed tracheal graft and investigate its cellular biocompatibility and biomechanical properties.Methods Bone marrow was isolated from tibial plateau of young New Zealand white rabbit,and bone mesenchymal stem cells(BMSCs)were obtained by whole bone marrow culture method and adherent purification method.Biomechanical test was performed for 3D printed trachea graft.After co-cultured of 3D printed trachea graft and BMSCs,cell morphology was observed and the proliferation index of the cells on 3D printed trachea graft was quantified using sulforhodamine B(SRB)assay.Results 3D printed trachea graft showed excellent biomechanical properties.Cell morphology was normal and cells grew well after co-culture with 3D printed trachea graft.The SRB assay indicated good proliferation of BMSCs on 3D printed trachea graft.Conclusions 3D printed trachea graft shows favorable cellular biocompatibility and biomechanical properties,and therefore can be used as a scaffold material for tissue-engineered trachea.

3D printed trachea graft;Biomechanical properties;Cellular biocompatibility; Tissueengineered trachea

史宏灿，Email:shihongcan@hotmail.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．002

国家自然科学基金（81170014，81370118）；扬州大学“高端人才支持计划”资助项目（201431）；江苏省2015年度普通高校研究生科研创新计划基金（KYLX15_1388）

2016-05-22）