3D打印β-TCP/HA/PLA骨移植支架材料的研究

许国军 朱咸兵 李勃 朱朋飞 王荣

518055深圳，清华大学深圳研究生院（许国军、朱咸兵、李勃）；100084北京，清华大学材料学院（许国军、李勃），生命科学学院（朱咸兵）；110016沈阳，中国科学院金属研究所（朱朋飞、王荣）

3D打印β-TCP/HA/PLA骨移植支架材料的研究

许国军 朱咸兵 李勃 朱朋飞 王荣

518055深圳，清华大学深圳研究生院（许国军、朱咸兵、李勃）；100084北京，清华大学材料学院（许国军、李勃），生命科学学院（朱咸兵）；110016沈阳，中国科学院金属研究所（朱朋飞、王荣）

目的 制备个性化的3D打印骨移植支架修复材料，以满足骨缺损患者的需求。方法 运用计算机软件CAD设计出三维木堆结构的模型图，通过三维气浮运动平台，使用3D打印方法模拟出三维木堆结构的复合β-磷酸三钙（β-TCP）、羟基磷灰石（HA）和聚乳酸（PLA）材料的支架。再对支架材料进行抽真空热处理，X射线能谱仪检测其氯仿残留量，扫描电镜观察支架材料的表面形貌，最后用噻唑蓝（MTT）法检测支架材料对人SV40转染成骨细胞hFOB1.19的毒性。结果 当打印浆料的挤出气压在137.9～413.7 kPa内，可打印出β-TCP/HA/PLA三维骨移植支架材料。成型后的三维骨移植支架材料经90℃保温抽真空处理及150℃热处理后能消除其中的氯仿；材料表面粗糙，拥有表面细孔和内部连通的微孔；其同hFOB1.19细胞共培养7 d，细胞毒性等级为0级。结论 本研究制备的3D打印β-TCP/HA/PLA骨移植支架材料表面粗糙而具有通孔，利于成骨细胞的培养，且骨诱导作用明显，体现出3D打印在制备骨移植多孔材料上拥有很大的优势和发展前景。

3D打印； 木堆结构； 骨移植； 多孔材料

Fund program:Special Funds of Strategic Emerging Industries in Shenzhen(CXZZ20130322164541915)

0 引 言

据统计，每年我国约有300万例的骨缺损病例，主要是由于交通安全事故导致的骨创伤性骨折、骨肿瘤及股骨头坏死等骨科疾病引起。在临床上骨缺损通常采用骨移植的方式进行修复填补和骨愈合。目前，应用于临床的骨移植材料主要包含以下3种：自体骨[1]、异体骨[2-3]和人造组织工程骨[4]材料。其中，自体骨与患者拥有最好的结合性，还拥有骨传导性和骨诱导性且在移植体内能够成骨，所以人们常把自体骨移植作为骨移植的金标准。然而，由于所取的骨量非常有限，往往不能满足患者的要求，尤其是对于大面积创伤的患者，取骨量成为其最大的限制因素，导致患者不能选用自体骨作为康复治疗骨疾病的材料。在欧美国家，因其具有完备的骨组织库和相关的法律体系保护措施，异体骨成为骨移植最常用的替代材料之一。但异体骨在植入人体后骨传导性较差，需要根据植骨移植以后的固定情况来决定是否加固金属。人造组织工程骨是骨移植材料的另一个重要来源，包含金属支架材料、生物陶瓷材料、聚合物支架材料[5]及复合材料等。3D打印骨支架技术[6]的兴起，使得人造组织工程骨越来越受到人们的青睐，为此，笔者拟研究复合β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）、羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）和少量聚乳酸（polylactic acid, PLA）材料，制备性能优异的生物陶瓷骨修复材料[7]，并通过3D打印快速成型设备将骨修复浆料打印出三维多孔支架[8]材料。此外，还可根据病人个性化的预定要求，制出任意复杂形状的多孔高活性骨修复材料。本研究将进一步改进传统骨修复材料存在的不足，推动高活性骨修复材料开发和快速成型技术的应用，为临床应用提供产品。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

PLA（黏度η=0.84dl/g，数均分子质量为1×105u）（山东省医疗器械研究所），氢氧化钙（Ca（OH）2，ACS，纯度≥95.0%）、磷酸（H3PO4，ACS，纯度≥85%）、HA（Ca5（PO4）3（OH），纯度≥97%，粒度＜100 nm）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），氯仿（CHCl3，分析纯，相对分子质量为119.38 u）（衡阳凯信化工试剂有限公司）。

FG100三维气浮运动平台（美国Aerotech公司），气体控制点胶设备（易孚迪感应设备（上海）有限公司），Mastersizer 2000型激光粒度仪（英国Malvern仪器有限公司），Rigaku D/max 2500 PC X射线衍射仪 (日本理学株式会社)，S-4800型场发射电子扫描显微镜（日本日立公司），Oxford X-Max 20电致冷X射线能谱仪（英国牛津仪器公司），Tecan Freedom Evolyzer-2200酶联免疫检测仪（瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 β-TCP的制备

采用水系合成法制备β-TCP，具体过程如图1所示。将购得的氢氧化钙和磷酸按一定的钙磷比即Ca/P=1.5，先加入磷酸，后加入氢氧化钙，混合于烧杯中，在恒温水浴锅中反应，反应式如下

然后抽滤，将得到的沉淀物置于洁净的球磨罐中，用氧化锆球球磨24 h，得到细粉；将粉末置于真空烘箱中干燥，90℃烘干2 h，得β-TCP的前驱体；再于850℃高温焙烧3 h，随炉空冷冷却后即得β-TCP。

图1 β-磷酸三钙的制备过程

1.2.2 3D打印浆料的制备

3D打印浆料的流变特性对于打印成型的三维支架材料的性能影响极大，为了研究HA[9]、β-TCP[10]和PLA[11]混合浆料的流变力学特性，共进行了6组实验。先以氯仿为溶剂配制质量分数为10%的不同含量β-TCP和HA的溶液，再分批加入PLA，配制出不同质量分数的浆料。表1为浆料中的氯仿除去后即3D打印支架材料中各组分的质量分数。浆料配好后，装填入打印的针管中，静置陈化24 h。

表1 3D打印支架材料中各组分的质量分数

3D打印的生物陶瓷材料可由公式（2）来表征其流变特性

式中：y是所采用浆料的流变特性参数（一般指弹性模量和临界剪切应力等），x是常数指数（取2.5左右），φgel是凝胶临界点对应的固含量，φ是所配制浆料的固含量，k是常数。由公式（2）可知，一般情况下，弹性模量只由φ和φgel决定。

研究表明，在3D打印过程中，对针管施加气压压力作用于浆料上时，浆料呈现一定的黏性，使浆料更易被挤出，流动性更好；挤出后，所产生的气压消失，这时浆料往往有一定的收缩弹性，陶瓷浆料会发生收缩，以便成型。

1.2.3 3D打印模型的建立

3D打印之前，必须要进行三维建模处理。三维模型的建立，可使所构建的三维支架材料更简便直观，且更易根据打印平台的实际尺寸来构建三维模型[12]。

本研究使用AutoCAD 2007[13]来构建三维木堆结构模型，三维木堆结构因结构简单且图形代码易于编写，被广泛用于科研研究。在图形建模完成以后，将所得的模型代码导出，得到可以编辑的代码，后者即能被机器识别。

本研究采用的FG100三维气浮运动平台，其运动精度为400 nm，定位精度为2～4 nm，可高精度地打印所设计的模型结构。采用的气体控制点胶设备可通过控制气体压力来控制挤出压力，调整好3D打印成型设备以后，调整挤出气体的气压值为137.9～413.7 kPa，所选用的针头内径为60～1 550 μm。

1.2.4 三维支架材料的脱离

陶瓷浆料在挤出成型的过程中，因有机溶剂挥发量的不同，边界与中间成型以后收缩量也不相同，边界收缩较快，收缩量也越大，往往会出现边界曲翘的现象，收缩量变化如图2所示。

依据上述的支架材料收缩特性，需要在材料成型以后进行支架与支撑玻璃片的脱离处理，且不能破坏支架的结构。

1.2.5 抽真空热处理

在支架材料与玻璃片脱离后，三维支架材料中仍含有一定量的有机溶剂氯仿。因生物学实验的要求比较严格，生物材料中不能有有机氯的残留；有机氯的残留会导致小鼠死亡，其半数致死量为1 194 mg/kg，故在后续实验中要脱去残留的氯仿。其抽真空热处理的过程如图3所示。将制得的三维支架材料在90℃的条件下干燥3 h，再于150℃预烧9 h。由于氯仿的沸点为61～62℃，故通过加热至90℃抽真空和150℃预烧可排出绝大部分的氯仿。

图3 三维支架材料的真空热处理过程

1.2.6 粒度分析

采用激光粒度仪分别对HA和β-TCP进行粒度分析，以便于对3D打印粉末材料的要求进行评估。

1.2.7 X射线衍射分析

采用X射线洐射仪对制得的β-TCP粉末进行检测。衍射仪采用Cu靶材作为X射线源，管电压为40 kV，管电流为200 mA，衍射角的扫描范围为5°～70°，扫描速度为5°/min。

1.2.8 扫描电镜观察

将制得的β-TCP粉末用水分散，取分散液滴于硅片上，干燥后喷金15 s，采用扫描电镜进行表面形貌分析。同样，对成型的β-TCP/HA/PLA三维支架表面进行喷金处理，再进行表面形貌分析。

1.2.9 X射线能谱分析

采用电致冷X射线能谱仪检测成型的β-TCP/ HA/PLA三维支架材料中的氯元素含量，通过定性和定量分析来确定材料中氯仿的残留量，从而进一步判断打印的三维支架材料的生物学性能。

1.2.10 细胞毒性测试

将人SV40转染成骨细胞hFOB1.19按5×103/孔接种于96孔培养板中，实验组分别加入不同成分的β-TCP/HA/PLA三维支架材料共培养7 d，同时设置对照组（不加三维支架材料）；吸弃培养液，每孔加入20 μl质量浓度为5 mg/ml的噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT）溶液，继续培养4 h；吸弃培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解；最后，用酶联免疫检测仪测定490 nm处各孔的吸光度（OD）值并进行统计分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（±s）表示，使用独立样本t检验比较同一时间点OD值的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 陶瓷粉末及打印浆料的表征

由水系合成法制备的无定形态的磷酸钙经850℃高温烧结处理后得β-TCP，其表面形貌及物相分析如图4所示。由图4A可知，制得的β-TCP颗粒近球形，尺寸为1～3 μm，均匀细小，烧结效果较好。整体分布较均匀，出现了部分团聚的现象，分析其原因，可能是在烧结过程中采用了随炉冷却的方法，出现了二次结晶的现象。由图4B可看出，制得的β-TCP的主要特征峰对应于X射线衍射标准卡片，物相较纯。

粒度分析结果表明，β-TCP和HA的粒度范围相近，均满足打印所用针头的要求。（图5）

按表1中各成分的配比，采用氯仿作为溶剂，得到不同成分的浆料，并对浆料进行流变分析。以质量分数为40%的PLA和质量分数为60%的β-TCP为例，其流变分析结果如图6所示。G'代表胶体浆料的储能模量[14]，G''代表胶体浆料的损耗模量。当达到G'＜G''时，浆料呈一定的黏性，才更易从针头中挤出；挤出过程完成后浆料发生回复，G'＞G''，且稳定在105Pa，浆料呈现一定的弹性性能，这样有利于陶瓷浆料的成型，并促进三维木堆结构的自支撑作用，使其不会因重力作用而塌陷，满足浆料的设计要求。

此外，当固含量提高时，浆料成型变快，但其干燥的速度也加快，往往会因为干燥过快而堵塞针头。所以，选择合适的打印浆料成分至关重要。陈化过程中，陶瓷浆料的流动性会显著提高，打印过程中的流动性亦会更好。

2.2 三维支架材料的表面分析

经90℃保温抽真空和150℃热处理后的β-TCP/HA/PLA三维支架材料，其表面能谱分析结果如表2所示；扫描电镜观察到其表面颗粒较为清晰，表面粗糙度较高，同时拥有表面细孔和内部连通的微孔（图7）。由于三维木堆结构的表面粗糙度高，在模拟体液（simulated body fluid,SBF）中与细胞共培养时，可增强细胞对支架材料的黏附作用，使得细胞能贴在材料表面生长，为之后的细胞培养提供了依据。表面细孔和内部连通的微孔则提供了细胞生长所需营养的流动通道，利于培养基的流动，从而促使细胞在贴壁生长完成后能持续增殖和分化。

表2 三维木堆支架结构的X射线电子能谱分析

2.3 三维支架材料的细胞毒性分析

图8为不同成分的β-TCP/HA/PLA三维支架材料对人SV40转染成骨细胞hFOB1.19的细胞毒性[15-16]结果，其中1～6号样品的成分见表1，7号为对照组。可以看出，hFOB1.19细胞与1～6号样品培养7 d后，细胞存活率[17]分别为0.767±0.045、0.757± 0.036、0.710±0.051、0.681±0.013、0.667±0.077和0.630±0.032，与对照组（0.583±0.042）比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。由此可判断，本研究制得的6种不同成分的β-TCP/HA/PLA三维支架材料的细胞毒性等级均为0级，可满足临床植入实验的要求。

图8 不同成分的β-TCP/HA/PLA三维支架材料与hFOB1.19细胞共培养7 d的细胞毒性结果

3 结论

本研究选取的粉末状3D打印材料的粒径为1～100 μm，在针头的可控范围内，以便在针筒中能顺利挤出成型。当所配浆料的剪切力较小时，G'＞G''，挤出之前浆料呈黏性，挤出方便；剪切力较大时，G''＞G'，挤出以后浆料伴随着细化，呈弹性可起到自支撑，有利于成型。打印成型后的三维骨移植支架材料经90℃保温抽真空处理及150℃热处理后，可消除其中的有机溶剂氯仿，从而降低残留的有机溶剂对细胞培养过程中细胞毒性的影响。细胞毒性结果表明，采用3D打印直写成型技术制备的不同成分的β-TCP/HA/PLA三维骨移植支架材料的细胞毒性均为0级，毒性较小符合移植[18]的条件。

利益冲突 无

（图2、4～6见插页4-10，图7见插页4-13）

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Research on 3D printed β-TCP/HA/PLA scaffolds for bone grafts

Xu Guojun,Zhu Xianbing,Li Bo,Zhu Pengfei,Wang Rong

Graduate School at Shenzhen,Tsinghua University,Shenzhen 518055,China(Xu GJ,Zhu XB,Li B);School of Materials Science and Engineering,Tsinghua University,Beijing 100084,China(Xu GJ,Li B),Division of Life and Health Sciences(Zhu XB);Institute of Metal Research,Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016,China (Zhu PF,Wang R)

Li Bo,Email:boli@mail.tsinghua.edu.cn

Objective To develop the personalized 3D printing scaffolds for bone grafts,to meet the needs of the patients with the bone defect.Methods The model of three-dimensional woodpile structure was designed by the software of computer-aided design(CAD).The β-tricalcium phosphate(β-TCP),hydroxyapatite(HA),and polylactic acid(PLA)composite scaffolds with three-dimensional woodpile structure was simulated using 3D printing method by three-dimensional air floating platform.The three-dimensional bone graft scaffolds was then vacuum heattreated,and the residual chloroform was detected by energy dispersive X-ray spectrometer.The morphology of the β-TCP/HA/PLA scaffolds was characterized by scanning electron microscope,and in vitro cytotoxicity against osteoblasts hFOB1.19 was assessed by thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)assay.Results When the extrusion pressure of printing slurry was 137.9-413.7 kPa,the three-dimensional bone graft scaffolds could be printed out. Then the scaffolds was vacuum treated at 90℃and preheated at 150℃,which could eliminate the solvent CHCl3. The three-dimensional bone graft scaffolds,with a through-hole and rough surface,was co-cultured with osteoblasts hFOB1.19 for 7 d,and it's cytotoxicity grade was grade 0.Conclusions The three-dimensional bone graft scaffolds have a through-hole and rough surface,which is favorable to the osteoblasts culture and bone induction,indicating the advantage and development prospects of 3D printing in the preparation of porous materials for bone grafts.

3D printing;Woodpile structure;Bone grafts; Porous material

李勃，Email:boli@mail.tsinghua.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．005

深圳市战略性新兴产业专项资金（CXZZ20130322164541915）

2016-05-20）