脂肪氧合酶高效制备关键技术研究

脂肪氧合酶高效制备关键技术研究

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12）属于氧化还原酶，是一类含有非血红素铁的蛋白质，能够专一催化氧化含有Z，Z-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，形成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物的双加氧酶，可作为面粉增白剂和增香剂、抗肿瘤药物前体、涂料与洗涤剂等生产原料，具有巨大的市场需求。由于商品化的LOX主要通过大豆浸提获得，受大豆来源的影响，产品批次间的性质差异较大，不利于下游产品的开发和应用。

近年来，随着LOX应用领域的拓展，国内外科学家等通过分子改造、高产菌构建及发酵过程优化的研究，以获得应用性能优良的LOX并实现其高效生产。Cristea，M（2005）研究在毕赤酵母中表达含锰的脂肪氧合酶和推定金属配体的定点突变；Bae，JH（2010）从铜绿假单胞菌PR3中发现了一种新的热稳定的LOX。其被纯化了34.3倍，复得率为5.14%，纯化后酶的Km和Vmax值分别为3 57 mmol/L和0 73 mu mol/min//mg。María等（2012）克隆了西兰花基因组中的脂肪氧合酶（BoLOX1）基因，序列分析显示BoLOX1和其他高等植物脂肪氧合酶相似，并分析了该基因的表达，结果表明BoLOX1在植物采后衰老过程中有较大提高。 María等（2012）克 隆 了 橄 榄 脂 肪 氧 合 酶c DNA（Oep2LOX1），并对光照、温度、损伤对脂肪氧合酶在橄榄果表皮中的表达的影响进行了研究。国内的江南大学、南京农业大学等在脂肪氧合酶高效制备技术上进行了深入的研究。如：CN201310287699.X公开了一种热稳定脂肪氧合酶突变体及其构建方法，通过PCR法分别对脂肪氧合酶的盖子结构201-TQRGQG-206进行G204P、G206P、G204P/G206P 及L6loop→PT linker突变，并得到具有热稳定性的脂肪氧合酶。与野生酶相比，脂肪氧合酶突变体在50℃下的半衰期及最适反应温度均有显著提高，改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。CN201210578451.4公开了一种酶活性及热稳定性提高的脂肪氧合酶，是在GenBank PA119公布的基因序列编码的蛋白质基础上，其N端氨基酸缺失，其中缺失尤以缺失30个为佳。使用该方法得到的新型脂肪氧合酶，酶学性质较好的突变株，热稳定性提高2.1倍，比酶活仍能维持初始的90%。陆信曜（2013）将来源于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的LOX基因在大肠杆菌（Escherichia coli）Rosetta（DE3）中进行分泌表达，并对重组酶进行了性质分析和热稳定性改造。其通过分段缺失重组LOX N端高柔性区域，在未影响催化效率的前提下提高了酶的热稳定性；通过突变、替换和缺失等策略降低“盖子”结构铰链loop的柔性，以提高LOX热稳定性；通过N末端融合表达自组装双亲短肽（SAP）提高LOX热稳定性和催化效率。陆信曜（2013）以研究室保存的脂肪氧合酶生产菌株重组大肠杆菌Rosetta（DE3）/pre-LOX为研究对象，在摇瓶水平上对培养基、诱导温度、诱导剂浓度、外源添加物进行优化；在3L发酵罐水平上对初始诱导菌体浓度（OD600）进行优化。摇瓶发酵条件下，诱导温度为20℃，当菌体OD600达到0.6，添加1 mmol/L诱导剂及0.5%吐温-20，胞外酶活达到8.4 U/mL；在3 L发酵罐上，诱导温度为20℃，当菌体OD600达到8.0，添加1 mmol/L诱导剂及0.5%十二烷基磺酸钠，胞外酶活为8.3 U/mL。章栋梁（2012）采用Plackett-Burman设计法，对影响重组枯草芽孢杆菌发酵产脂肪氧合酶的7个相关因子进行筛选，并建立枯草芽孢杆菌产脂肪氧合酶的最佳工艺。结果表明对重组菌发酵产酶具有显著影响的因子是乳糖、发酵时间和发酵温度。刁含文（2015）研究了重组鱼腥藻脂肪氧合酶定点突变及突变酶酶学性质，重组鱼腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）基因来自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定点突变技术将Ana-LOX的421位和40位的缬氨酸（Val）突变为丙氨酸（Ala），获得突变体V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期为3.8 min。而突变酶V421A和V40A在50℃的半衰期分别为4.4 min和7.0 min。突变酶V421A/V40A的半衰期为8.3 min，与野生型Ana-LOX相比，提高了1.18倍。相对于野生酶，突变酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分别提高了4.83%、41.58%、80.07%。突变酶的最适反应温度均比野生酶（35℃）高5℃。CN201410053650.2公开了一种酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法，利用定向进化技术对鱼腥藻脂肪氧合酶分子进行定向改造，经多轮易错PCR和DNAShuffling，获得了酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，酶活力为21 420 U/mL，比野生型提高了2.17倍。

随着应用研究的深入，LOX在食品加工、化工、医药等领域展现良好的应用前景。在此背景下，如何获得具有良好应用性能的LOX并实现其高效发酵生产，将成为国内外相关研究的重要方向。

（江南大学图书馆张群）