玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

马芳芳，王瑞云，蒋明义

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.南京农业大学 生命科学学院，江苏 南京 210095)



玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

马芳芳1，2，王瑞云1，蒋明义2

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.南京农业大学 生命科学学院，江苏 南京 210095)

摘要：玉米中ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力，然而截至目前对其潜在的分子机制却知之甚少。为构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体，并检测其在宿主酵母菌MaV203中的自激活活性和毒性，利用gateway技术，以实验室保存的重组质粒pMD19T-ZmMPK5为模板，扩增得到带有attB位点的ZmMPK5基因的ORF片段，通过BP重组反应和LR重组反应，最终将该片段构建到诱饵表达空载体pDEST32上，PCR及测序鉴定结果表明，成功构建了阅读框方向和序列均正确的重组诱饵载体pDEST32-ZmMPK5。用PEG/LiAc法将重组诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5转化酵母菌株MaV203感受态细胞，通过缺陷型平板表型分析以及X-gal分析实验检测诱饵载体表达的蛋白对宿主细胞是否具有毒性和自激活作用。最终结果表明构建的诱饵载体对宿主酵母菌MaV203既无毒性也无自激活活性，可用于后续研究，为进一步利用酵母双杂交方法从玉米cDNA文库中筛选与ZmMPK5相互作用蛋白奠定了基础。

关键词：ZmMPK5；酵母双杂交；诱饵载体；MaV203；自激活

促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Proein kinase, MAPK)级联反应是生物体适应外界环境刺激的重要的细胞信号转导途径[1,2]。作为级联途径中最后一个组成成分，植物MAPK在各种信号转导中处于核心地位，参与调控了众多诸如病原物、激素信号、活性氧、干旱、盐渍、低温、热激、渗透胁迫、机械刺激及损伤、O3、紫外、细胞死亡、重金属、氧化胁迫等信号转导过程以及植物生长发育过程[3～8]。但目前人们对MAPK是怎样调控这些过程的却知之不多。解开MAPK作用机理的关键一步是鉴定与MAPK相互作用的蛋白并阐明其在植物体内的生理功能。目前已经明确的MAPK互作蛋白非常有限，因此需要通过一定的技术手段如酵母双杂交技术来筛选与MAPK相互作用的蛋白，从而更加明确MAPK级联途径在植物信号转导中的机制和作用。

玉米中ZmMPK5属于MAPK家族的A类蛋白激酶，与OsMPK6、AtMPK6、PsMAPK、NtSIPK同源。前人研究表明ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力[9～13]，然而其具体的作用机制尚未明确。由于蛋白质相互作用在生命活动中扮演着重要角色，研究ZmMPK5相互作用蛋白将是阐明其作用机制的有效途径。

酵母双杂交系统具有许多优势，它的一个很重要的功能就是发现新的蛋白质以及发现蛋白质的新功能，即从cDNA文库中筛选出与已知蛋白相互作用的未知蛋白，进而为探索该蛋白的相关特性及功能奠定基础[14,15]，而构建有效的诱饵载体是运用酵母双杂交系统开展蛋白互作研究的重要前提基础[16～18]。本研究拟通过构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体，并对其进行毒性和自激活活性的检测，以期利用诱饵载体从玉米cDNA文库中筛选与之相互作用的未知蛋白，从而为探索ZmMPK5的新功能提供线索。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1菌株、质粒和载体

大肠杆菌DH5α、pMD19T-ZmMPK5质粒由本实验室保存；酵母菌MaV203(MATα,leu2-3,112,trp1-901,his3Δ200,ade2-101,gal4Δ,gal80Δ,SPAL10::URA3,GAL1::lacZ,HIS3UAS GAL1::HIS3@LYS2,can1R,cyh2R)、 入门载体质粒pDONR222、诱饵空载质粒pDEST32(含GAL4 DNA-Binding Domain)、猎物空载质粒pDEST22(含GAL4 Transcriptional-Activation Domain)、对照质粒pEXP32/Krevl、pEXP22/RalGDS-wt、pEXP22/RalGDS-m1、pEXP22/RalGDS-m2由 Invitrogen公司提供。

1.1.2主要试剂

PlatinumPfxDNA Polymerase、Gateway®BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、Gateway® LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、Proteinase K Solution购自Invitrogen公司；卡那霉素、庆大霉素、鲑鱼精DNA、PEG3350、LiAc、3-Amino-1, 2, 4-Triazole(3AT)、X-gal为Sigma公司产品；DNA Marker、Taq DNA Polymerase、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、酵母质粒提取试剂盒、溶壁酶购自天根生化科技有限公司；酵母培养所用的培养基购自Clontech公司。

1.1.3引物

attB1-ZmMPK5:

5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGC

AGGCTTCATGGACGGCGGGGGGCA-3′

attB2-ZmMPK5:

5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT GGGTCCTAGCTGAAATTGAACTTTGGCTAC-3′

M13-Forward:

5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′

M13-Reverse:

5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′

Bait-Forward:

5′-AACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTG-3′

Bait-Reverse:

5′-AGCCGACAACCTTGATTGGAGAC-3′

所有引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2ZmMPK5诱饵载体的构建

参照Gateway Technology操作手册，利用Gateway技术，首先使用含attB位点的引物attB1-ZmMPK5和attB2-ZmMPK5扩增pMD19T-ZmMPK5质粒(实验室保存)，得到attB-flanked ZmMPK5 PCR 产物，经回收纯化后与attP-containing donor vector pDONR222即入门载体进行BP重组反应，反应结束后，将产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜。次日以M13 Forward和M13 Reverse为引物做菌落PCR鉴定，选取阳性结果，进行测序。提取测序结果正确的重组入门载体质粒，与诱饵表达空载体pDEST32的质粒进行LR重组反应，反应产物转化DH5α感受态细胞后涂布于含庆大霉素抗性LB平板上，过夜培养，次日以attB1-ZmMPK5和attB2-ZmMPK5为引物做菌落PCR鉴定，选取阳性结果进行测序，最终将测序结果正确的重组诱饵质粒命名为pDEST32-ZmMPK5，同时进行保菌。

1.3酵母感受态细胞的制备及转化

制备：将酵母菌MaV203划线于YPDA(Yeast Extract Peptone Dextrose Adenine Hemis-ulfate Medium)平板上，30 ℃倒置培养2～3 d，挑单克隆接种于2 mL YPDA中，过夜培养。12 000 r·min-1，离心15 s，弃上清，1 mL 1×TE重悬沉淀。12 000 r·min-1，离心15 s，弃尽上清，沉淀重悬于100 μL 1×TE/1×LiAc溶液中，即为酵母感受态细胞。

转化：每100 μL酵母感受态细胞加1 μg质粒、10 μL (100 μg)灭活的鲑鱼精DNA、600 μL 1×TE/1×LiAc/40% PEG 3350；30 ℃，200 r·min-1，30 min；加70 μL DMSO混匀，42 ℃热激15 min，冰浴1 min；12 000 r·min-1离心30 s，弃上清；100 μL 1×TE重悬沉淀，涂于相应SD缺陷型平板；30 ℃培养2～3天。

不同质粒转化样品如下：单转pDEST32；单转 pDEST32-ZmMPK5；共转pDEST32-ZmMPK5和pDEST-22；空白对照：共转pDEST-32和pDEST-22；强阳性对照：共转pEXP32/Krel和pEXP22/RalGDS-wt；弱阳性对照：共转pEXP32/Krev1和pEXP22/RalGDS-m1；阴性对照：共转pEXP32/Krev1和pEXP22/RalGDS-m2。

1.4含诱饵质粒酵母菌的鉴定

单转诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5至酵母感受态细胞(以单转pDEST32空载质粒作为对照)，SD-Leu平板上30 ℃培养；待菌落明显长出后，挑取单克隆接种于5 mL SD-Leu；30 ℃，200 r·min-1过夜培养；其中4 mL菌液进行酵母质粒的提取，以Bait Forward和Bait Reverse为引物做质粒PCR鉴定；将鉴定为阳性的剩余酵母菌菌液进行保菌，即加甘油至终浓度为25%，-80 ℃保存。

1.5诱饵质粒毒性检测

将单转pDEST32-ZmMPK5诱饵质粒和单转pDEST32空载质粒(对照)的酵母菌按照相同条件涂布在SD-Leu平板上，30 ℃培养，针对两者的菌落生长速度、大小、数目、形态等特征进行观察。分别挑取二者的单克隆，并按相同条件接种于SD-Leu液体培养基，30 ℃，200 r·min-1培养16～18 h后，检测两者的OD600。

1.63AT浓度检测诱饵载体自激活活性

按照1.3方法，分别共转化pDEST32-ZmMPK5和pDEST-22、空白对照、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照；待不同转化的SD-Leu-Trp平板上菌落明显长出后，制备Master板，即分别挑取不同转化的两个单克隆在同一SD-Leu-Trp平板上划短线；30 ℃培养18 h后，用无菌绒布将Master板上的菌落复制到含不同浓度(0、10、25、50、75、100 mM)3AT的SD-Leu-Trp-His平板上，复制后马上清试，30 ℃培养24 h后再清试一遍；30 ℃培养48 h后观察结果。

1.7诱饵载体自激活作用再验证(X-gal分析检测lacZ基因表达情况)

按照1.3方法，分别共转化pDEST32-ZmMPK5和pDEST-22、空白对照、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照；同1.6方法制备Master板，30 ℃培养18 h；取适当大小无菌NC膜平铺于YPDA平板的培养基上，用无菌绒布将Master板上的菌落复制到YPDA平板中的NC膜上；30 ℃培养24 h后将膜取出并浸泡于液氮中15 s，使膜上的菌落固定；用镊子小心地将膜取出并平铺到浸润了Z buffer/X-gal溶液(16.1 g·L-1Na2HPO4·7H2O，5.50 g·L-1Na3PO4·H2O，0.75 g·L-1KCl，0.246 g·L-1MgSO4·7H2O，20 g·L-1X-gal)的滤纸上，37 ℃孵育8 h，观察颜色变化。

2结果与分析

2.1ZmMPK5诱饵载体的构建和鉴定

参照Gateway Technology操作手册，首先获得attB-flanked ZmMPK5 全长PCR产物，通过BP重组反应获得入门载体pDONR222-ZmMPK5，将测序结果正确的入门质粒和诱饵空质粒pDEST32进行LR重组反应，转化子以attB1-ZmMPK5和attB2-ZmMPK5为引物做菌落PCR鉴定，结果显示(图1)，成功扩增了大小为1 200 bp的ZmMPK5全长片段。选取阳性克隆进行测序并对测序结果进行分析，最终的结果表明获得了与预期相符的序列及读码框均正确的与GAL4 DNA-Binding Domain相融合的诱饵表达载体pDEST32-ZmMPK5。

图1　诱饵表达载体pDEST32-ZmMPK5的PCR电泳鉴定Fig.1　PCR products of pDEST32-ZmMPK5　　注：1.DNA分子质量标准250 bp DNA ladder; 2.PCR产物Note: 1.250 bp DNA ladder; 2.The electrophoresis results of pDEST32-ZmMPK5 PCR products

2.2含诱饵质粒酵母菌的鉴定

酵母感受态细胞转化诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5，以转化pDEST32空载作为对照，涂于SD-Leu平板，待菌落长出后分别挑取两者的单克隆于5 mL SD-Leu培养基中，30 ℃摇菌过夜，次日提取酵母质粒，以Bait Forward和Bait Reverse为引物做质粒PCR鉴定。图2结果显示对照质粒的PCR产物大小为550 bp，而诱饵质粒PCR产物大小为1 750 bp，即ZmMPK5 全长1 200 bp与载体上的一段550 bp的和，结果表明诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5已转化进入酵母菌中，成功获得了含诱饵质粒的酵母菌。

图2　诱饵质粒PCR电泳鉴定Fig.2　PCR products of Bait plasmind　　注：1.DNA分子质量标准Marker Ш; 2.诱饵质粒PCR产物; 3.空载质粒PCR产物Note: 1.DNA Marker Ш; 2.PCR products of pDEST32-ZmMPK5; 3.PCR products of pDEST32

2.3诱饵质粒毒性检测

将转化了诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5和转化了空载质粒pDEST32的酵母菌按照相同的条件涂布在SD-Leu平板上，30 ℃培养2～5 d，观察二者的生长状态，结果显示：转化诱饵质粒的酵母菌同对照相比，两者在菌落生长速度、大小、形态以及数目上并没有明显的差异。另外，分别挑取二者的单克隆，按照相同的条件接菌于SD-Leu液体培养基，30 ℃，200 r·min-1培养16～18 h后检测OD600，结果显示：两者的OD600值均达到0.8以上。以上结果表明，转化了诱饵质粒的酵母菌可以正常生长，诱饵质粒所表达的融合蛋白对宿主酵母菌MaV203本身没有毒性，可以继续用于后续的筛库工作。

2.43-AT浓度检测诱饵载体自激活活性

根据ProQuestTMTwo-Hybrid System(invitrogen)，我们通过HIS3报告基因的表达与否来检测诱饵载体的自激活活性。HIS3编码的酶参与组氨酸的生物合成，它的作用可以被特异性竞争抑制剂3AT所抑制。 如果诱饵载体本身或者与猎物空载体共同作用后有激活作用，那么HIS3报告基因的转录就被激活，转化后的酵母菌就能够在缺陷型平板SD-Leu-Trp-His上生长[15]。由于酵母菌株本身也有低水平的HIS3表达，为了消除本底干扰，我们通过在培养基中加入适量浓度的3AT，以抑制菌株自身低水平HIS3的表达。本实验中我们在三缺平板SD-Leu-Trp-His培养基中分别添加了0 、10 、25 、50 、75 和100 mM 6个浓度3AT，从图3可以看出，诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5与猎物空质粒pDEST22共转化后，在含0、10、25 mM 3AT平板上都有生长，但随着浓度的增加，菌落生长逐渐受到抑制，当浓度达到50 mM时菌落刚好在上面不生长，表明诱饵质粒在此浓度下对宿主酵母菌无自激活作用，且后续筛库及相关鉴定试验中均应使用50 mM浓度3AT。

图3　3AT浓度检测诱饵载体自激活作用结果Fig.3　3AT concentration sensitivity determination for testing Bait　　注：1.强阳性对照; 2.弱阳性对照; 3.阴性对照; 4.空白对照; 5.pDEST32-ZmMPK5+pDEST22共转化。A. B. C. D. E. F. 分别为0、10、25、50、75、100 mM 3AT浓度的SD-Leu-Trp-His+3AT平板。Note: 1.Strong positive interaction control; 2.Weak positive interaction control; 3.Negative interaction control; 4.Negative self-activation control; 5.Test of self-activation.A. B. C. D. E. F. 0、10、25、50、75、100 mM 3AT SD-Leu-Trp-His+3AT plate respectively.

2.5X-gal assay 再验证诱饵载体自激活活性

根据ProQuestTMTwo-Hybrid System(invitrogen)，我们还可以通过LacZ报告基因是否表达来进一步检测诱饵载体的自激活活性。如果诱饵载体本身或者与猎物空载体共同作用后有激活作用，那么LacZ报告基因的转录就会被激活，该基因编码的β-半乳糖苷酶以X-gal为底物进行染色反应时呈现蓝色[15]。图4结果显示，NC膜上的酵母菌体经液氮固定后，37 ℃孵育8 h，通过Z buffer/X-gal溶液进行显色时，强阳性对照在半小时之内就很快变蓝，弱阳性对照则为较浅的蓝色，阴性对照和空白对照始终不变蓝，而诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5与猎物空质粒pDEST22共转化后的菌落8 h之内也没有变蓝，从而进一步说明了诱饵载体pDEST32-ZmMPK5在宿主酵母菌内无自激活活性。

图4　X-gal验证诱饵质粒自激活作用结果Fig.4　X-gal assay for testing of self-activation　　注：1.强阳性对照; 2.弱阳性对照; 3.阴性对照; 4.空白对照; 5.pDEST32-ZmMPK5+pDEST22共转化。Note: 1.Strong positive interaction control; 2.Weak positive interaction control; 3.Negative interaction control; 4.Negative self-activation control; 5.Test of self-activation.

3讨论与结论

以往针对MAPK的研究主要集中在其活性调控方面，然而近年来备受瞩目的是一些MAPK下游互作靶蛋白的发现，这些发现将MAPK的功能拓展到了新的领域。拟南芥中AtMYB41被AtMPK6磷酸化而激活，参与了盐胁迫响应，提高了植株的盐胁迫忍耐力[19]。Singh等以水稻为材料，通过酵母双杂交技术筛选出80对MAPK蛋白互作组，构建了第一个水稻MAPK蛋白质相互作用网络图谱[20]。植物细胞中还可能存在更多的MAPK底物，这些可能的底物包括转录因子、转录调节子、剪接因子、受体、组蛋白等[21,22]。然而这些可能的MAPK底物在植物体内的生理功能及其参与的信号转导途径仍有待阐明。

酵母双杂交系统目前被广泛应用于植物功能基因组及蛋白组的研究当中，通过该方法可以快速而高效地分析蛋白质间相互作用。但是由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母细胞中表达时能够发挥转录激活作用，使之成为酵母双杂交系统假阳性率高的一个重要原因之一[15,23]。减少筛选背景降低假阳性是酵母双杂交实验的一个关键内容。因此，在构建诱饵载体之后，要确定诱饵质粒转入酵母菌表达的诱饵蛋白没有自激活作用[23～25]。另外还需检测诱饵蛋白是否对宿主酵母菌的生长产生毒性，这样才能够确定诱饵载体能否用于后续的筛库试验。

本研究将玉米ZmMPK5全长ORF与含有含GAL4 DNA-Bingding Domain的pDEST32载体重组，通过PCR鉴定及序列测定表明诱饵载体pDEST32-ZmMPK5构建成功。经毒性检测，转化了诱饵质粒的酵母菌同对照相比，两者在菌落生长速度、大小、形态以及数目上并没有明显的差异，表明诱饵质粒所表达的融合蛋白对宿主酵母菌MaV203本身没有毒性。为了排除诱饵质粒表达的蛋白是否具有激活酵母细胞中报告基因的可能性，即检测诱饵蛋白的自激活性[25]，本研究对该酵母系统中HIS3报告基因进行了检验，通过含不同浓度3AT缺陷型平板测试实验，结果表明诱饵质粒在50 mM 3AT浓度下背景干扰最小，对宿主酵母菌无自激活作用。为了进一步检测诱饵载体的自激活活性，我们还通过LacZ报告基因的表达与否进行了验证。最终结果显示，与阳性对照相比诱饵载体不会出现显色反应，说明诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5在宿主酵母菌内不能激活LacZ报告基因的表达，诱饵蛋白本身没有自激活活性。

综上结果，玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体成功构建，诱饵蛋白表达稳定，对宿主酵母细胞既无毒性也无自激活活性，可作为诱饵蛋白使用，为后续利用酵母双杂交系统筛选与ZmMPK5相互作用蛋白提供了有力的实验基础。

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(编辑：邢国芳)

Construction and self-activation detection of bait vector ofZmMPK5 in yeast two-hybrid system

Ma Fangfang1,2, Wang Ruiyun1, Jiang Mingyi2

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

Abstract:In maize (Zea mays), the mitogen-activated protein kinase ZmMPK5 has been shown to be involved in abscisic acid (ABA)-induced antioxidant defence, and to enhance the tolerance of plants to drought, salt stress and oxidative stress. However, the underlying molecular mechanisms were poorly understood. In order to construct the bait vector of ZmMPK5 in yeast two-hybrid system and detect its self-activation and toxicity in the host yeast strain MaV203, attB-flanked ORF fragment of ZmMPK5 was amplified using pMD19T-ZmMPK5 as DNA template. The fragment was then successfully fused into PDEST32 vector by BP and LR recombination reaction using gateway technology. The constructed bait plasmid of pDEST32-ZmMPK5 was transformed into MaV203 competent cells by PEG/LiAc method and the toxicity and self-activation of the bait vector was tested by the phenotype analysis and X-gal assay. Final results showed that the bait vector pDEST32-ZmMPK5 had no toxicity and self-activation to the host yeast strain MaV203, and could be used for further research of screening interacting protein of ZmMPK5 from maize cDNA library by yeast two-hybrid technology.

Key words:ZmMPK5； Yeast two-hybrid； Bait vector； MaV203； Self-activation

中图分类号：S513；Q78

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)03-0170-06

基金项目：国家自然科学基金(30970238)；山西农业大学博士启动基金(2013YJ04)；山西农业大学科技创新基金(2014022、2014YZ2-5)

作者简介：马芳芳(1984-)，女(回)，山西长治人，讲师，博士，研究方向：植物逆境生理和分子生物学

收稿日期：2015-12-08修回日期：2015-12-30