毛尖蘑粗多糖对H22荷瘤小鼠的抑廇作用及Bcl－2表达的影响

吕冬霞　罗文哲　张淑红　王长山　薛　勇　(佳木斯大学基础医学院，黑龙江　佳木斯　154007)



毛尖蘑粗多糖对H22荷瘤小鼠的抑廇作用及Bcl－2表达的影响

吕冬霞罗文哲张淑红王长山薛勇(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

〔摘要〕目的探讨毛尖蘑子实体粗多糖( MJMP)对H22荷瘤小鼠Bcl－2表达的影响。方法建立H22小鼠模型，随机分为4组，对H22模型小鼠进行MJMP处理，计算肿瘤生长抑瘤率，采用SP免疫组织化学方法检测小鼠肿瘤组织中Bcl－2蛋白的表达;通过RT－PCR方法检测肿瘤组织中Bcl－2 mRNA的表达。结果MJMP低、高剂量对小鼠H22移植肿瘤均表现抑制作用，肿瘤抑制率与阴性对照组比较差异显著( P＜0．01) ;免疫组化证明，MJMP可减少Bcl－2蛋白的阳性细胞百分率，与阴性对照组比较差异显著( P＜0．01) ;应用RT－PCR方法表明，经过MJMP处理后，Bcl－2 mRNA表达与阴性对照组比较明显减弱( P＜0．01)。结论MJMP对H22肿瘤的抑制可能与Bcl－2 mRNA及蛋白低表达有关。

〔关键词〕毛尖蘑多糖; Bcl－2;凋亡; H22

肝癌常见的治疗手段主要有手术治疗、介入治疗、放化疗、生物靶向治疗等方法〔1〕，但同时给机体带来很多的不良反应。真菌作为天然的药物和食物，含有的菌类多糖具有抗肿瘤作用〔2～4〕。本研究将毛尖蘑子实体提取的粗多糖( MJMP)作用于H22荷瘤小鼠，采用SP免疫组化学法和RT－PCR法检测小鼠肿瘤组织中Bcl－2的表达，旨在探讨MJMP抑制肿瘤的机制。

1材料和方法

1. 1材料毛尖蘑:大兴安岭呼玛县韩家园林业局松涛鹿苑公司;昆明种近交系雌性小鼠:佳木斯大学实验动物中心(许可证号: SYXK黑2006－004，普通级，普通环境饲养) ; H22小鼠肝癌细胞株:中国医学科学院肿瘤研究所。Trizol: Gibco公司;淋巴细胞分离液、红细胞裂解液: Beyotime生物试剂公司;总RNA提取试剂盒、反转录cDNA合成试剂盒:大连Takara生物公司;β－actin多克隆抗体:北京博奥森生物有限公司。环磷酰胺( CTX) :江苏恒瑞医药股份有限公司。

1. 2动物分组与用药常规造模，24 h后，随机分组: MJMP(采用热水浸提方法改良〔5〕)高剂量组、MJMP低剂量组、阳性对照组( CTX)、阴性对照组(生理盐水)。各组均灌胃的方式进行药物处理，药物剂量均为0．2 ml/d，1次/d，连续给药14 d。

1. 3肿瘤生长抑瘤率的测定给药14 d后，断颈髓处死小鼠，无菌条件下剖取肿瘤实体，称重，计算肿瘤生长抑瘤率，肿瘤生长抑瘤率= (阴性对照组平均肿瘤重量－给药组平均肿瘤重量) /阴性对照组平均肿瘤重量×100%

1. 4免疫组化法检测肿瘤组织Bcl－2蛋白表达取小鼠肿瘤组织常规方法制备免疫组化切片。显微镜下观察蛋白表达情况，随机选择5个视野细胞计数，进行定量分析。蛋白表达阳性的细胞为明显的棕黄色染色，而蓝色细胞为阴性细胞。

1. 5 RT－PCR方法检测肿瘤组织Bcl－2 mRNA的表达按说明书要求提取肿瘤组织细胞总RNA，经RNA鉴定后将逆转录产物cDNA进行PCR反应。PCR反应引物为Bcl－2:上游5'－CCTGGCACCTGGCGGATAGC－3'，下游5 '－CGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGAAC－3，β－actin:上游5 '－AATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG－3'，下游5'－CGCCTA GAAGCACTTGCGGTG－3'。以上PCR样品取出后利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。应用凝胶成像系统扫描分析各条带，依据各条带的光密度和面积对扩增产物进行定量分析，以β－actin密度作为参考定量标准，计算Bcl－2/β－actin的值。

1. 6统计学方法应用SPSS11．5软件进行方差分析( AVONA)、Q检验。

2结果

2. 1 MJMP对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用CTX及MJMP低、高剂量对小鼠H22移植肿瘤均表现抑制作用。阴性对照组小鼠的平均肿瘤重量为( 2．739±0．318) g，CTX组和MJMP低、高剂量组小鼠平均瘤重分别为( 1．132±0．187) g、( 1．508±0．240) g和( 1．242±0．217) g，比阴性对照组明显减少( P＜0．01) ; MJMP低、高剂量组和CTX组的肿瘤抑制率分别是44．94%、54．65%和58．67%。

2. 2 MJMP对H22荷瘤小鼠肿瘤组织Bcl－2的蛋白表达Bcl－2阳性表达为黄色阳性细胞。CTX组〔( 40．12±7．62) %〕和高、低剂量组〔( 44．58±6．34) %、( 49．64±6．92) %〕较阴性对照组的Bcl－2〔( 66．33±7．59) %〕差异显著( P＜0．01)，CTX组和CJMJ治疗组Bcl－2阳性细胞百分率表达均明显减弱。

2. 3 MJMP对H22荷瘤小鼠肿瘤组织Bcl－2 mRNA的表达

1、阴性对照组; 2、低剂量组; 3、高剂量组; 4、CTX组图1 RT-PCR法检测H22小鼠肿瘤组织Bcl-2 mRNA的表达

见图1。Bcl－2的mRNA表达在阴性对照组呈过表达( 0．25±0．02)，CTX组和MJMP组的Bcl－2 mRNA表达明显减弱( 0．15± 0．03、0．16±0．02、0．21±0．02)。

3讨论

本试验结果表明，MJMP和CTX能够明显抑制H22荷瘤小鼠肝癌实体瘤的生长，其中低剂量MJMP的抑瘤作用低于CTX。肝癌细胞的Bcl－2基因高表达，可抑制肝癌细胞的凋亡，是肝癌形成的重要因素之一。Bcl－2可与线粒体及内质网膜相结合〔6〕。目前认为Bcl－2主要通过以下几个途径体现抑制细胞凋亡的作用: ( 1) Ca2+在细胞内的浓度升高可以导致细胞凋亡，当内质网膜中Bcl－2高表达，可抑制Ca2+在内质网管的释放，从而影响了细胞凋亡; ( 2)线粒体上的Bcl－2通过抗过氧化反应，保护脂质膜和保持细胞的氧化状态，抑制氧自由基的产生，来抑制细胞凋亡; ( 3) Bcl－2参与组成线粒体孔道，调节线粒体膜对凋亡蛋白前体的通透性，封闭Bax形成的孔道以达到保护细胞凋亡的目的; ( 4) Bcl－2和Bax两种蛋白结合，可以抑制细胞凋亡; ( 5) Bcl－2还可以通过阻止线粒体中的细胞色素C释放，阻断Caspase蛋白酶的激活，阻止细胞凋亡的级联反应过程，而抑制细胞凋亡; ( 6) Bcl－2还可能通过控制细胞信号转导的途径来抑制细胞的凋亡〔7〕。有研究表明在肝癌细胞中Bcl－2的表达增高，细胞呈高分化，异型性明显，提示Bcl－2高表达与肝癌细胞的高分化有一定的相关性〔8〕。因此去除或减弱Bcl－2基因产物达到治疗的目的，成为肝癌基因治疗的一个新靶点，肝癌患者的预后与Bcl－2基因及蛋白表达关系非常密切，临床上可以指导有效、合理地治疗，判断肝癌的预后。

本试验结果显示，MJMP能够减少H22肝癌细胞中Bcl－2蛋白的表达，可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。

4参考文献

1中国抗癌协会肝癌专业委员会．原发性肝癌规范化诊治专家共识〔J〕．临床肿瘤学杂志，2009; 14( 3) : 259－69．

2 Hengartner MO．The biochemistry of apoptosis〔J〕．Nature，2000; 407 ( 7) : 770－6．

3周怡，耿越．多糖与凋亡关系探讨〔J〕．中草药，2007; 38( 4) : 623－6．

4李建军．灵芝多糖免疫调节作用与抗肿瘤作用的关系及作用机制的研究〔D〕．广州:第一军医大学硕士论文，2007．

5范晓艳，吕冬霞，刘爽，等．毛尖蘑粗多糖提取方法的研究〔J〕．黑龙江医药科学，2010; 33( 4) : 20－1．

6翟中和，王喜忠，丁明孝．细胞生物学〔M〕．北京:高等教育出版社，2000: 463．

7 Adams JM，Cotry S．The Bcl－2 protein family: arbiters of cell survival 〔J〕．Science，1998; 281( 5381) : 1322－6．

8 Zeppa P，Benincasa G，Fulciniti F，et al．Apoptosis and cytologic differentiation in hepatocellular carcinoma on fine needle aspiration samples〔J〕．Acta Cytol，1996; 40( 5) : 861．

〔2015－06－09修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者:罗文哲( 1976－)，男，副教授，硕士，主要从事肿瘤发生机制与生物学治疗研究。

基金项目:佳木斯大学重点研究项目( No．Sz2013－002)

〔中图分类号〕R730. 52

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0298-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 020

第一作者:吕冬霞( 1965－)，女，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤发生机制与生物学治疗研究。