复方穿蛭透皮贴对家兔骨关节炎的作用机制

王丽娜　王冬梅　宋红敏　齐佳悦　王新成　(吉林医药学院，吉林　吉林　132013)



复方穿蛭透皮贴对家兔骨关节炎的作用机制

王丽娜王冬梅宋红敏齐佳悦王新成(吉林医药学院，吉林吉林132013)

〔摘要〕目的研究探讨复方穿蛭透皮贴对家兔实验性骨关节炎作用机理。方法健康清洁级新西兰白兔，随机分为空白组、模型组和治疗组。治疗组及模型组进行改良Hulth法造模。造模成功后，治疗组予复方穿蛭透皮贴右膝关节外敷，2d 1次，4 w后分别进行X线和HE染色检查，并抽取3组关节液，用ELISA法检测白细胞介素( IL)－1β、IL－6、肿瘤坏死因子( TNF)－α和前列腺素( PG) E2的含量。结果治疗组经X线检查，股骨髁、胫骨平台关节缘呈现唇样骨质增生不同程度变小，关节间隙宽，软骨下骨质密度淡化; HE染色较均匀，关节软骨表面平滑，关节软骨表层细胞排列轻度变形;关节液中IL－1β、IL－6、TNF－α和PGE 2的含量的含量水平显著下降( P＜0．05)。结论复方穿蛭透皮贴对骨关节炎有一定的抑制作用。

〔关键词〕复方穿蛭透皮贴;骨关节炎;细胞因子

骨关节炎( OA)患者常出现局部关节的疼痛、肿胀及功能障碍等症状，严重地影响生活质量。研究发现〔1〕，细胞因子白细胞介素( IL)－1、IL－8、IL－6、肿瘤坏死因子( TNF)－α和前列腺素( PG) E2等是骨关节炎症反应的主要因素〔1～3〕。复方穿蛭透皮贴处方由中药甲珠、阿魏、三七、水蛭等十余味药材组成，临床治疗OA疗效显著。现代药理研究表明，阿魏、水蛭、三七均具有抗炎作用;水蛭注射液可以明显降低脑组织TNF－α和IL－1β的含量，能够抗脑缺血后炎症反应，从而起到脑保护作用;三七皂苷可以明显抑制炎症引起的脂质沉积的增加，同时减少炎症细胞因子TNF－α和IL－1的产生〔4，5〕。本实验旨在研究现代纯中药制剂复方穿蛭透皮贴对兔膝OA细胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的影响及作用机制。

1材料与方法

1. 1动物资料新西兰白兔36只(购于吉林医药学院实验动物中心)，体质量2．0～2．5 kg，雌雄各半，室温下饲养。随机分为空白组，模型组和治疗组，每组12只。除空白组外，模型组和治疗组造模之后，开始连续给药4 w，模型组不作任何处理，治疗组用透皮贴( 0．45 g/每贴)贴敷患侧膝关节，纱布固定，每2 d换药1次。复方穿蛭透皮贴(自制) :实验用中药材均购于吉林大药房，经质量检查，符合《中国药典》2010年版(Ⅰ部)相关项下规定。试剂IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的ELISA试剂盒，购于上海慧颖生物科技有限公司。

1. 2动物模型制备采用改良Hulth法造模。将实验兔右膝关节消毒麻醉后进行膝前内侧切口，使关节暴露并切断关节前交叉韧带及内侧半月板，止血，关闭伤口。术后不固定患肢，使其于标准动物饲养笼中自由活动并可进食。术后肌注青霉素20万U，伤口连续7 d换药。术后1 w每日强迫活动30 min，分2次驱赶，4 w后可获得OA模型。

1. 3取材及处理治疗前和末次治疗后，分别拍摄兔右膝关节X线侧位片。空白组、模型组以生理盐水1 ml右后腿膝关节腔注射，治疗组右膝关节贴敷，并用纱布固定，2 d换药1次，共4 w后，抽取右后腿膝关节液。施行膝关节穿刺，证实刺入关节腔后，注入0．9%的生理盐水0．5 ml，反复回抽、注入3次后，再尽量抽出腔内液体。抽取关节液后，每只兔肌注2万U庆大霉素，以防膝关节感染。各实验兔获得标本量在0．4～0．6 ml，平均0．5 ml，于－20℃低温冰箱中保存待测。空气栓塞处死实验兔，取股骨端进行病理学观察。

1. 4苏木素－伊红( HE)染色每例标本经10%甲醛固定，10%硝酸脱钙后，取材得到股骨内侧髁矢状剖面标本1块。经石蜡包埋，切片后，用HE染色，置显微镜下观察。

1. 5检测方法采用双抗体ELISA法测定IL－1β、IL－6、TNF－α 及PGE2:关节液标本处理加样后，置于4℃恒温箱内静置24 h，取出加入分离剂充分混匀，4℃温度下离心2 min，弃去上清液，由自动放免测量仪测定样品浓度。

1. 6统计学方法采用SPSS12．5统计学软件进行单因素方差分析。

2结果

2. 1 X线检查空白组膝关节内外侧间隙均匀一致，股骨髁、胫骨平节面轮廓清晰;模型组股骨髁、胫骨平台关节缘出现唇样骨质改变，关节间隙变窄;治疗组股骨髁、胫骨平台关节缘呈现唇样骨质增生不同程度变小，关节间隙宽，软骨下骨质密度淡化。见图1。

图1兔膝骨关节X线片

2. 2 HE染色空白组关节软骨面光滑整齐，无裂隙或缺损，软骨细胞数量中等，排列整齐，间质均匀。模型组关节软骨组织严重破坏，关节软骨表面缺损，软骨表面粗糙，可见表层基质有丢失，软骨基质染色不均，细胞分布不均匀。关节软骨发生了退变，膝OA模型成功。治疗组关节软骨表面平滑，细胞部分缺失，分层较清楚，关节软骨表层细胞排列轻度变形，染色较均匀。见图2。

2. 3细胞因子测定模型组关节液中细胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的含量与空白组差异均显著( P＜0．05) ;治疗组与模型组差异显著( P＜0．05)。见表1。

图2兔膝骨关节HE染色(×100)

表1各组关节液中细胞因子水平比较(±s，ng/ml，n=12)

表1各组关节液中细胞因子水平比较(±s，ng/ml，n=12)

与空白组比较: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;与模型组比较: 3) P＜0．05，4) P＜0．01

组别　IL－1β　IL－6　TNF－α　PGE2空白组　5．128±1．427　 11．475±0．125　 1．211±3．524　 3．127±6．354模型组　27．012±0．2451)36．587±0．3652)15．204±3．0121)26．104±1．9571)治疗组14．396±1．2871) 3)20．042±2．5411) 4)11．144±0．7822) 3)23．210±0．6732) 3)

3讨论

复方穿蛭透皮贴具有活血化瘀、通络止痛的作用。该制剂是在传统贴膏剂穿蛭膏的基础上，改进制剂工艺，加入透皮吸收促进剂促进药物有效成分的释放、吸收，使制剂临床疗效明显提高。本实验结果表明，复方穿蛭透皮贴能够抑制细胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的释放，改变软骨细胞代谢环境并对OA具有抑制作用。此外，复方穿蛭透皮贴与其传统膏剂穿蛭膏相比较，其对细胞因子IL－1β和TNF－α的抑制率分别提高了8．2%和9．0%〔6〕，说明采用现代制剂工艺，利用经皮给药技术，制剂处方中加入促进吸收渗透剂可显著提高制剂疗效。

4参考文献

1贾乙，李晓辉．炎症因素在泡沫细胞形成中的作用及三七皂苷对其影响〔J〕．第三军医大学学报，2005; 27( 10) : 972－4．

2郑筱英．中药新药临床研究指导原则2001版〔M〕．北京:中国医药科技出版社，2001: 326－8．

3梁健芬，董少龙，窦维华，等．水蛭注射液对大鼠脑缺血再灌注后TNF－α、IL－1β和ICAM－1蛋白表达的影响〔J〕．陕西医学杂志，2006; 35( 12) : 1605－7．

4 Martel Pelletier J，Boileau C，Pelletier JP，et al．Cartilage in normal and osteoarthritis conditions〔J〕．Best Pract Res Clin Rheumatol，2008; 22 ( 2) : 251－84．

5贺牡丹，王小平，陈同生．白介素－1β诱导关节软骨细胞凋亡的分子机理〔J〕．中国细胞生物学学报，2011; 33( 1) : 49－54．

6曲保忠，杨帆，孙鹏飞，等．穿蛭膏对家兔实验性骨关节炎细胞因子IL－1β和TNF－α的影响〔J〕．时珍国医国药，2011; 2( 6) : 1424－5．

〔2014－11－29修回〕

(编辑苑云杰)

通讯作者:王新成( 1968－)，男，副主任技师，主要从事中药新药研发研究。

基金项目:吉林省教育厅重点资助项目(吉教科合字〔2011〕第283号)

〔中图分类号〕R285. 5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0290-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 015

第一作者:王丽娜( 1978－)，女，副教授，硕士，主要从事中药制剂与质量标准研究。