TGF-β3在关节软骨组织工程的研究进展

刘登榜，邓江

(1遵义医学院，遵义563000；遵义医学院第三附属医院)



TGF-β3在关节软骨组织工程的研究进展

刘登榜，邓江

(1遵义医学院，遵义563000；遵义医学院第三附属医院)

骨关节炎目前尚无有效治疗方法。转化生长因子-β3(TGF-β3)是转化生长因子超家族蛋白之一，可与生物支架联合诱导细胞成软骨分化，可诱导骨髓间充质干细胞、软骨细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞等种子细胞成软骨分化，可与成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白等其他生长因子联合促进软骨细胞生长，在骨关节的软骨生长和重建中起着关键性的作用。

转化生长因子-β3；关节软骨；骨关节炎；成软骨分化

骨关节炎以关节软骨退行性病变为主要临床特点，以往临床主要采用软骨下骨钻孔方法来修复软骨[1]，但效果较差。目前自体或异体软骨、骨膜移植及干细胞治疗是骨关节炎的研究热点。转化生长因子-β3(TGF-β3)是细胞因子中TGF家族的主要成员之一，可促进软骨细胞的增殖分化、促进细胞外基质形成，抑制IL-1、MMPs 和TNF-α等多种炎性介质的活性，降低机体免疫反应，在创伤修复方面发挥重要作用，尤其在软骨的生长和重建中起关键作用[2，3]，在骨关节炎关节软骨的修复中具有广阔的应用前景。以往临床常使用自体软骨移植术修复损伤软骨，但取材有限。近年研究发现，体外增殖诱导干细胞培养可作为补充软骨缺损的有效方法[4]。TGF-β3可诱导细胞成软骨分化，诱导分化培养差别可能与细胞种类、种植密度和细胞代数等选择有关联。目前用于体外培养的细胞很多，主要包括有来源于骨髓、软骨、脂肪、滑膜、肌肉、胚胎等多能干细胞。本文就近年来国内外对TGF-β3修复骨关节软骨的研究进行综述。

1　TGF-β3的生物学结构功能及其分布

TGF-β有3个亚型分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β是一类多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。TGF-β的3种亚型均是以同型二聚体形式、分子量约75 kDa的前体蛋白组装合成[5]，在pH降低、酸化、蛋白酶催化等情况下被催化裂解出两部分。一部分是由二硫键连接的二聚体前体肽，又称作前体相关蛋白(LAP)；另一部分是从LAP羧基端裂解下来的成熟TGF-β3，分子质量大小约24 kDa，由两个结构相同、分子质量约12 kDa的单体通过二硫键交联组成。裂解前的TGF-β3前体蛋白呈非活性状态，与LAP之间由高亲和力的非共价键连接，LAP起着保持TGF-β非活性状态作用，只有两者分离后，TGF-β3才发挥生物学活性。TGF-β3分泌后，形成大的潜在复合物(LLC)以共价键连接并储存于细胞外基质(ECM)，该复合物包括潜在TGF-β3结合蛋白(LTBP)、mTGF-β3前体蛋白、LAP三部分。

TGF-β3被机体多种细胞表达，在胎盘、脂肪组织、胚胎、肝脏、骨及骨髓、肿瘤等中都有其分布，以自分泌和旁分泌的形式分泌至胞外。TGF-β3在胞外作为配体，通过结合到细胞膜表面的丝氨酸/苏氨酸激酶受体介导，再通过胞内SMAD信号通路激活转录因子Smad2/Smad3，激活Smad4并与之结合成为复合体，后者移位至细胞核，调控下游TGF-β3基因转录表达，行使其生物学功能。

2　TGF-β3在诱导软骨分化中的作用

2.1TGF-β3与生物支架目前,用于替代向软骨生长的类软骨基质主要分为非人工合成材料(自体或异体软骨、脱钙骨基质DBM、胶原蛋白、透明质酸、藻酸盐等)和人工合成材料。自体软骨无免疫性，但取材少，对软骨缺损面积较大的修复较困难。异体软骨能解决大面积缺损，但免疫反应强，修复效果差。目前人工合成的组织材料逐步发展成熟，主要是模拟软骨基质成分，通过离心沉淀、冷冻干燥等理化方法构建的软骨组织工程支架，旨在提供体内外干细胞黏附增殖和干细胞向软骨分化、再生的微环境，达到在生化结构和物理力学性能方面与正常生长软骨相近的组织材料，支架材料主要有羟基磷灰石(n-HA)、壳聚糖(cs)、丝素蛋白(SF)、聚乳酸(PLA)等。但是，人工支架材料存在生物组织相容性、机械力学、免疫排斥等不足。有学者[6]分别将TGF-β3和人脱钙骨基质(DBM)植入动物关节软骨缺损模型中，发现TGF-β3转染后的骨髓间充质干细胞(BMSC)能显著的增加DBM上的软骨生成量，同时还大大增加了COL(Ⅱ)，COL(X)和Aggrecan的产生。TGF-β3与上述材料向成软骨分化，研究从解剖学证实较满意地修复了软骨缺损，而在组织学上与正常的软骨组织还是有差别，修复组织呈纤维软骨改变，最终软骨细胞终末分化，修复效果不佳[7,8]。Pei等[9]从软骨组织中提取脱细胞软骨基质(DECM)作为体外细胞生长所需的立体微环境，用于干细胞的增殖分化培养，更近似地向软骨形成。DECM来源于自身软骨组织，更接近其软骨细胞表型，所含胶原、蛋白聚糖等成分几乎没改变，成分量较正常软骨基质稍少。作为干细胞黏附的载体，可被认为是一种具有发展前景的理想组织支架。单纯使用细胞生长因子、体外生物支架及干细胞诱导分化来促使软骨细胞增殖及表达，脱离了正常软骨形成分化的过程，研究还需从类似软骨形成的自身微环境出发。

2.2TGF-β3与种子细胞临床早期使用自体软骨移植术修复软骨，但取材有限。研究发现，体外增殖诱导培养干细胞可解决大面积软骨缺损来源。种子细胞来源丰富，一定条件下具有成软骨分化潜能的特性，均能表达蛋白聚糖及Ⅱ型胶原成分，对软骨的修复具有重要作用。然而随着细胞的传代，细胞向肥大增生及去分化方向发展，修复的软骨呈纤维样软骨改变[7,10]。可能与细胞分化的发生发育以及细胞因子的多因素调控有关。诱导干细胞成软骨分化的细胞因子很多。TGF-β3可诱导细胞成软骨分化，诱导方法分为外源性诱导和内源性诱导。诱导分化培养差别可能与细胞种类、种植密度和细胞代数等选择有关联。目前用于体外分化培养的细胞很多，主要包括有来源于骨髓、软骨、脂肪、滑膜、肌肉、胚胎等多能干细胞。

2.2.1BMSCBMSC是一类运用较广泛的多潜能干细胞，取材方便，具有良好的多向诱导分化潜能，不同条件下可分别向成软骨细胞、成骨细胞、成脂肪细胞分化，是目前研究最多的种子细胞。但骨髓中BMSC含量极少，不足0.01%[11]。通过体外传代培养，纯化增殖干细胞。至今尚未发现BMSC其特异性表面抗原标志物[12]，现常见分离纯化方法主要包括贴壁筛选法和密度梯度离心筛选法。也有从外周血提取间充质干细胞的报道[13]。胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF-β家族等均具有促进骨髓干细胞成软骨分化。早期实验认为,TGF-β1在BMSC成软骨细胞诱导方面起着重要的作用[14];Barry等[15]研究发现,TGF-β3、TGF-β2较TGF-β1成软骨诱导作用更佳。使用BMSC成软骨分化的实验研究已屡见不鲜，然而针对其培养基、血清浓度及诱导成分目前没有一个较统一的要求，成软骨细胞标志物表达也不相互一致。BMSC成软骨分化是一个复杂的过程，很多因素决定其转归，主要包括高密度细胞培养和球团培养。但是，目前BMSC仍是研究最成熟的种子细胞。

2.2.2软骨细胞软骨细胞是最早用于软骨组织工程的种子细胞[16],优点是来源于人体，无免疫排斥反应。但软骨细胞的培养较其他干细胞取材不便，获取细胞少,体外培养困难。随着传代培养，细胞易去分化肥大化，表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等软骨标志物较少。临床上采用自体软骨细胞移植技术修复软骨，但由于软骨细胞获取困难，需对患者两次行创伤性手术及供体部位病变等因素受到限制。有研究表明，共同培养软骨细胞和间充质干细胞能够增强软骨表型和TGF-β3的敏感性[17]。基于软骨细胞的起源提出了软骨前体干细胞的假说，研究表明软骨前体干细胞能向软骨表型系谱分化[18]，并持续到成年期，但需要进一步实验阐释。国内丁然等[19]证实,TGF-β3较TGF-β1、TGF-β2对于诱导前软骨干细胞的增殖和成软骨分化的正向调节作用更为显著。TGF-β3还可以调节TGF-β1与TGF-β2的比例,抑制成纤维细胞的增生,减缓细胞纤维化进程[20]。

2.2.3脂肪间充质干细胞脂肪来源间充质干细胞来源于中胚层，可以多向诱导分化，具有易获得，来源丰富、增殖能力强等优点,逐渐成为组织工程领域研究热点。有学者认为，脂肪干细胞较骨髓来源干细胞易取材、培养，更接近向软骨细胞表型分化[21]。但是也有研究观点与其相悖[22～24]，认为脂肪干细胞向软骨细胞分化的能力弱，分泌软骨基质及Ⅱ型胶原的能力低于BMSC。有学者发现，TGF-β3与骨形态发生蛋白(BMP)-6联合培养更能增加脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的潜能[25,26]。作者认为，脂肪间充质干细胞已属干细胞二级分化，多向脂肪分化转归，较BMSC成软骨分化的潜能弱。

2.2.4滑膜间充质干细胞有研究证实，体外培养滑膜间充质干细胞相比BMSC、骨膜细胞、脂肪间充质干细胞等有更好的增殖活性和成软骨能力[27]。更为重要的是，理论上滑膜间充质干细胞来源的软骨细胞和关节软骨细胞具有相似的基因表达谱。软骨的形成起于骨干两端骺软骨的第二骨化中心，滑膜间充质干细胞分泌的细胞外基质可以推迟软骨细胞去分化衰老，并可以增强其向软骨细胞再分化能力[28]。滑膜间充质干细胞与多层软骨细胞片共培养后植入兔骨软骨缺损，研究显示能够有效地修复软骨[29]。Li等[30]结合缺氧条件，在含有成纤维生长因子-2作为诱导的组织特异性细胞外基质中培养滑膜间充质干细胞可高效促进其增殖，并且可以下调肥大增生标记基因的表达，在体外三维微环境下基于干细胞的软骨缺损的修复提供了高质量的干细胞。

3　TGF-β3与其他生长因子

细胞因子是软骨发生发育中必不可少的成分。除了TGF-β3可调节关节软骨的生长发育，成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子，BMP家族等。胰岛素样生长因子是第一个被发现的可以调控软骨形成的多肽，促进干细胞向软骨细胞分化，增加软骨细胞外基质的合成，减慢基质降解并抑制软骨细胞的凋亡[31]。早期的细胞成软骨分化，不是由单个因子所控制的，而是多个细胞因子共同参与促进其向软骨表达。有研究表明添加BMP-2能明显促进体外TGF-β3诱导培养滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化[32]。联合转染多种成软骨分化的生长因子的研究也在一定程度上修复了软骨缺损，但最终避免不了软骨的退化。活化T细胞核因子(NFAT)被发现于T细胞内一种与人IL-2启动子相结合，依赖Ca2+/钙调神经磷酸酶(CaN)的核转录因子,包括NFATc1、NFATc2、NFATc3、 NFATc4及TonEBP共5个亚型[33]。CaN是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员。CaN主要表达于细胞质中,组织分布广泛，通过使底物NFAT去磷酸化和核内转位，调剂下游基因的转录和表达。在免疫细胞的免疫应答中对细胞因子的基因和其他基因的转录发挥重要的作用。非免疫系统通过去磷酸化和核内转位发挥功能调节作用。大量研究表明，CaN/NFAT信号通路不仅参与多种免疫系统疾病的发生发展，调控肿瘤发生过程的基因转录表达，介导心肌肥大的病理生理过程，还参与破骨细胞的分化。最近有研究表明，NFAT在调控关节软骨合成代谢和分解代谢的平衡和抑制软骨细胞过度增生肥大化方面起着关键性的作用[34]。

4　展望

目前，TGF-β3介导基因表达的机制已有多种途径的报道，被大部分学者接受的是胞内SMAD通路上调其靶向基因表达，再通过旁分泌和自分泌蛋白修复关节软骨损伤。而研究NFAT依赖CaN磷酸化后再经过核转位和其他蛋白共同调节下游靶基因TGF-β3的表达，促进软骨基质合成分泌，同时抑制促软骨分解的炎性因子对软骨进一步的损害。因此，在SMAD信号通路和NFAT之间可能存在有一定的共同联系，有待进一步证实研究。临床上用于关节软骨损伤修复的方法均有不同程度的局限性，国内外TGF-β3治疗软骨已奠定了一定的基础，在此基础上优化软骨组织支架，筛选出组织特异性的种子细胞，结合基因工程研究，相信对组织工程修复软骨将带来新的希望。

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