卵胞浆内单精子注射的精子优选技术的研究进展

李洁，郑娟，周黎明

(宁波市妇女儿童医院，宁波　315012)



卵胞浆内单精子注射的精子优选技术的研究进展

李洁，郑娟，周黎明*

(宁波市妇女儿童医院，宁波315012)

随着辅助生殖技术的发展，卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术为众多不孕不育夫妇带来了生育可能。精子的质量对于胚胎的生长发育和ICSI的临床结局有着至关重要的影响。先进的精子筛选技术可以提高具有高度DNA完整性的、结构完整的成熟精子用于受精的机会。本文简要综述了现有的ICSI精子优选技术及其对ICSI结局的影响，希望为ICSI技术的临床应用与进一步的发展提供新的思路。

卵胞浆内单精子注射；精子筛选；辅助生殖技术

(JReprodMed2016，25(9)：856-860)

卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术是一种利用显微操作将单个精子注射到卵胞浆内，卵母细胞受精后，经体外培养形成早期胚胎，再选择优质胚胎移植到母体子宫内着床发育的一种辅助生殖技术。ICSI技术的应用，大大降低了辅助生殖所需精子的浓度、活动力和形态学标准，为众多不孕不育的夫妇带来了生育可能。

正常生殖过程中，能与卵细胞进行受精的精子必须具有各种生理学功能并且通过重重障碍，例如穿过卵细胞透明带，然而ICSI技术绕过了正常生殖的绝大部分步骤，人为选择形态正常的精子注射进入了卵细胞[1]。因此，所选精子的质量对于ICSI结局有着尤为重要的影响。目前，精液样本主要经过直接洗涤法、密度梯度离心法或上游法等处理[2]，然后将适量精子加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，经显微镜下观察，从中选择形态正常(头部呈卵圆形，长4.0～5.5 μm，宽1 μm；顶体占整个头部的40%～70%；颈部、中段或尾部无异常)、活动力良好(前向运动)的精子注射到卵细胞胞浆中。然而，人为选择的形态正常、活动力良好的精子，并不能确保其遗传物质正常。有研究发现，具有明显正常形态的精子也可能含有DNA碎片，而具有受损DNA的精子比例与ICSI所得胚胎的质量和妊娠结局呈负相关[3]。反之，用异常形态的精子，如圆头精子和异常轴丝的精子进行ICSI，已有健康婴儿出生[4-5]。因此，除了现有的常规的精子活动力和形态学检查标准之外，发现新的优化的ICSI精子选择技术，对于提高ICSI的成功率具有重要意义。本文简要综述了现有的ICSI精子优选技术及其对ICSI结局的影响，希望为ICSI技术的临床应用与进一步的发展提供新的思路。

一、透明带(ZP)结合实验

人的卵细胞ZP能选择性地结合具有正常染色质和正常功能的精子。ZP结合实验即将人成熟卵细胞与精子置于同一微滴中，共培养一段时间，从而选出能与ZP结合的精子。Paes等[6]将每位患者的成熟卵细胞分为数量相等的两组，一组进行ICSI，另一组进行ZP-ICSI(即将能与ZP结合的精子注射入卵胞浆)，比较分析后发现，虽然两组间的受精率差异并不显著，但ZP-ICSI组的高质量胚胎率和胚胎移植率均显著高于常规ICSI组。Black等[7]也发现，相比常规ICSI，ZP-ICSI的移植率和临床妊娠率有所增高。说明ZP结合实验可能是一种有效的ICSI精子优选方法。金锐等[8]则将患者分为两组，一组进行常规ICSI，一组进行ZP-ICSI，比较两组患者的受精率和卵裂率均显示无显著差异，但ZP-ICSI组的优胚率、可利用胚胎率和临床妊娠率均高于常规ICSI组。Casciani等[9]也将患者分为两组，一组进行常规ICSI，一组进行ZP-ICSI，比较两组间的受精率、妊娠率、移植率和活产率显示均无显著差异，但对ZP-ICSI组的患者进行分析发现，精子与ZP的结合率与精子浓度及正常形态率正相关，并且，具有高ZP结合率精子的患者ICSI后妊娠率与活产率更高，说明ZP结合能力受损的精子并不适用于ICSI技术。

综上所述，ZP结合实验虽然能选出质量更佳的精子，但对于ICSI结局的改善仍存在争议，可能并不适用于所有不孕不育患者。并且，可用于结合实验的卵细胞数量十分有限，难以大规模地应用于临床。

二、透明质酸(HA)结合实验

精子形成时，在精子细胞膜重塑过程中，ZP受体形成，HA受体也随之形成。因此，能与HA结合的精子也可以与ZP结合，并且HA可大量体外合成，比ZP更易获得。HA结合实验即将HA微粒与精子置于同一微滴中，共培养一段时间，从而筛选出能与HA牢固结合的精子。

已有大量研究发现，能与HA结合的精子的非整倍体率更低[10]；具有DNA碎片、精蛋白缺陷的风险更小，用于ICSI时受精率、妊娠率和移植率均显著提高[11]；含有正常形态细胞核的比率更高，发育形成的胚胎质量更好[12]。也有研究报导，HA-ICSI(即将能与HA结合的精子注射入卵胞浆)可增加活产率，降低流产率和遗传并发症[13]。Parmegiani等[14]对86例进行常规ICSI的患者与293例进行HA-ICSI的患者的受精率、胚胎质量、移植率和妊娠率进行了比较分析，发现相比常规ICSI组，HA-ICSI组患者的胚胎质量和移植率显著增高，说明ICSI前进行HA结合实验有助于选出高质量的精子，改善辅助生殖技术的结局。

反之，也有研究发现，HA结合实验选出的精子与训练有素的胚胎学家根据传统形态学标准在显微镜下挑选出的精子无显著的DNA完整性的差异[15]。而且，仅在严重畸形或者HA结合能力差的精液样本中，HA-ICSI才有助于受精率和妊娠率的提高[16]。这提示我们，HA结合实验可能仅对于严重男性因素不育的患者具有重要价值。Majumdar等[17]对精液参数正常、不明原因不孕的156位患者进行研究，发现相比常规ICSI，HA-ICSI并不能提高受精率、优质胚胎数量、临床妊娠率和移植率，但能降低流产率，这可能是由于精子基因组对胚胎形成的影响主要发生在晚期(从8细胞期到分娩)，因此，精子的DNA碎片率更可能影响流产率，而不太可能影响受精率、卵裂速度和受精后2～3 d的胚胎质量。

综上所述，HA结合实验对ICSI精子的优选具有重要意义。虽然对于HA结合精子的DNA碎片率和其对ICSI临床结局的影响等仍存在争议，这可能是由于HA结合实验仅对部分不孕不育患者有益，如精子与HA结合率低的患者。要想更确切地了解HA结合实验对ICSI结局的影响，还有待进一步地研究。

三、Zeta电位筛选

成熟精子的细胞膜表面电位约为-16～-20毫伏，称为Zeta电位，在精子获能之后，Zeta电位下降。利用精子的这个特点，Kheirollahi-kouhestani等[18]将离心管放入乳胶手套中，上下颠倒2～3次，使离心管管壁带正电荷，用于黏附带负电荷的精子，离心去除不能与管壁黏附的精子，然后加入含10%白蛋白的F10培养液中和电荷，洗脱并获得了黏附于管壁的精子；并且发现，利用Zeta电位筛选出的精子具有较低的DNA碎片率，可提高ICSI的受精率和妊娠率。Ainsworth等[19]用微流体静电技术，电泳分离出了具有正常Zeta电位的精子，也证实了上述结论。Razavi等[20]对Zeta电位筛选出的精子、HA结合实验筛选出的精子和未经筛选的精子进行比较分析，发现两种筛选方法均可提高精子的正常形态率和正常顶体率，并且Zeta电位筛选出的精子的DNA完整性显著高于HA结合实验筛选出的精子和未经筛选的精子。目前，有关利用Zeta电位筛选精子的报导数量还十分有限，该技术的安全性、适用性和有效性还有待进一步的研究。

四、细胞凋亡标志物筛选

在体细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)外部化，即从细胞膜内层转移到外层，是细胞凋亡的早期标志之一。然而，此过程也是正常精子获能过程中的一个步骤。因此，在精子获能之前检测到的外部化的PS是精子早期凋亡的标志[21]。外部化的PS可与膜联蛋白V特异性的结合，利用磁激活细胞分离(MACS)的方法，可将膜联蛋白阴性的精子即未发生早期凋亡的精子筛选出来。Dirican等[22]发现，用MACS筛选出的未凋亡精子进行ICSI，卵裂率、移植率和妊娠率均有所提高。并且，在对精子进行密度梯度离心之前进行MACS筛选比在离心后进行MACS筛选更有益于分离出高质量的精子[23]。

Zahedi等[24]对Zeta电位筛选出的精子、细胞凋亡标志物筛选出的精子和未经筛选的精子进行了质量评估，发现相比未经筛选的精子，两种方法筛选出的精子均具有更高的正常形态率，更低的DNA碎片率和精蛋白缺陷率，这说明用Zeta电位和细胞凋亡标志物进行筛选均可提高ICSI精子的质量；并且，对于严重男性因素不育的患者，用细胞凋亡标志物能更有效地选出具有正常顶体和精蛋白的精子。

综上所述，根据细胞凋亡标志物对ICSI精子进行筛选，可有效提高精子质量，有益于提高ICSI结局，有望成为新的精子筛选指标。

五、精子双折射检测

双折射效应是光线射入非均质物质后，由于速度不同而折射出的两道不同偏振光线间存在相位延迟而产生。具有正常细胞核、顶体和能动的尾部的精子质地致密，细胞质非均质，在透射电子显微镜下会出现双折射的现象[25]。

Gianaroli等[26]用偏振光显微镜检测精子的双折射，可获得与透射电子显微镜相似的精子内部细胞质结构信息，而不影响精子的生命力和活动力，且发现正常精液样本中的双折射精子比例显著高于寡畸精子症或睾丸取精获得的精液样本；并且，对于严重男性因素不育的患者，卵胞浆内注射具有双折射现象的精子比行常规ICSI术具有更高的临床妊娠率、继续妊娠率和移植率。

双折射现象还可以区分精子是否已发生顶体反应，若双折射现象出现在顶体后部，则精子已发生了顶体反应；若双折射现象在头部、顶体和细胞核均有出现，则表明精子具有完整的顶体，还未发生顶体反应。在ICSI中，注射已发生顶体反应的精子有助于诱导卵细胞激活和进一步的生长发育[27-28]，增加受精率和卵裂率[29]。Gianaroli等[30]根据精子的双折射特点，将71对严重男性因素不育的夫妇分成3组，分别卵胞浆内注射已发生顶体反应的精子(已反应组)、未发生顶体反应的精子(未反应组)、和既有已发生顶体反应的也有未发生顶体反应的混合精子(混合组)，比较3组间的ICSI结局，发现受精率和胚胎发育能力在3组间没有显著差异，而移植率和分娩率均为已反应组>混合组>未反应组，且已反应组和未反应组间差异显著。从生理角度解释，卵胞浆内注射已发生顶体反应的精子更接近自然地受精过程，因此有助于所获胚胎的生长发育。

综上所述，精子双折射的检测作为一种无创的技术手段，有助于改善严重男性因素不育患者的ICSI结局，有望成为一种新型的精子筛选方法和诊断工具。

六、能动精子细胞器的形态学检查

能动精子细胞器形态学检查是在超高放大倍数(≥6 000倍)显微镜下观察分析精子的亚细胞结构：顶体、顶体后板、颈部、尾部和细胞核。用经细胞器形态学检查的精子进行ICSI的技术被称为胞浆内形态学选择精子注射(IMSI)技术[31]。

有研究发现，对常规ICSI反复失败的患者进行IMSI，可提高所获得的胚胎质量，显著提高移植率、临床妊娠率和活产率，显著降低流产率[32-33]。Balaban等[34]研究发现，在未经选择的不育患者中，IMSI并不能改善临床结局，而在严重男性因素不育的患者中，相比ICSI，IMSI的移植率有显著提高。Setti等[35]研究发现，对卵巢刺激正常应答的患者，IMSI和ICSI的结局无明显差异；而对卵巢刺激应答不良的患者，相比ICSI，IMSI的受精率和移植胚胎的数量有所下降，说明IMSI不利于对卵巢刺激应答不良的患者。La Sala等[36]对48位采取IMSI的患者和73位采取ICSI的患者进行了随机对照试验，发现两组患者的临床妊娠率和活产率均无显著差异。综上所述，在不同的患者亚群中，能动精子细胞器的形态学检查对于辅助生殖技术的结局有着截然不同的影响，目前还不适合在未经选择的不育患者中进行大规模的临床推广。

有限的卵细胞数量和不理想的精子质量是ICSI技术的成功率不尽人意的两个瓶颈。卵细胞的数量受到生理条件限制难以大幅度提升，因此，从精液样本中挑选出高质量的精子进行ICSI显得尤为重要。目前已有的ICSI精子优选技术都能一定程度上提高所选精子的质量，但对不同患者的适用性不同，可能仅能提高部分患者的ICSI结局。因此，将不孕不育患者分成不同的亚群，分别运用不同的精子优选方法，进行个体化治疗，可能是未来精子优选技术和辅助生殖技术的发展趋势。此外，这些精子优选技术要想进行大规模的临床应用，还需要进行严格地安全性评估。

[1]Nudell DM，Lipshultz LI. Is intracytoplasmic sperm injection safe? Current status and future concerns[J]. Curr Urol Rep，2001，2：423-431.

[2]李志凌，谢文燕. 辅助生殖技术中的精液优选处理[J]. 生殖医学杂志，2007，16：209-212.

[4]Sahu B，Ozturk O，Serhal P. Successful pregnancy in globozoospermia with severe oligoasthenospermia after ICSI[J]. J Obstet Gynaecol，2010，30：869-870.

[5]朱海波，张志宏，王瑞雪，等. 圆头精子卵胞浆内单精子注射成功妊娠并诞生活婴一例报告[J]. 生殖医学杂志，2014，23：410-413.

[6]Paes Almeida Ferreira de Braga D，Iaconelli A Jr，Cássia Sávio de Figueira R，et al. Outcome of ICSI using zona pellucida-bound spermatozoa and conventionally selected spermatozoa[J/OL]. Reprod Biomed Online，2009，19：802-807.

[7]Black M，Liu DY，Bourne H，et al. Comparison of outcomes of conventional intracytoplasmic sperm injection and intracytoplasmic sperm injection using sperm bound to the zona pellucida of immature oocytes[J]. Fertil Steril，2010，93：672-674.

[8]金锐，包俊华，白刚，等. 精子透明带结合法优选精子行卵胞浆内单精子注射临床研究[J]. 生殖医学杂志，2013，22：155-158.

[9]Casciani V，Minasi MG，Fabozzi G，et al. Traditional intracytoplasmic sperm injection provides equivalent outcomes compared with human zona pellucida-bound selected sperm injection[J]. Zygote，2014，22：565-570.

[10]Jakab A，Sakkas D，Delpiano E，et al. Intracytoplasmic sperm injection：a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploidies[J]. Fertil Steril，2005，84：1665-1673.

[11]Nasr-Esfahani MH，Razavi S，Vahdati AA，et al. Evaluation of sperm selection procedure based on hyaluronic acid binding ability on ICSI outcome[J]. J Assist Reprod Genet，2008，25：197-203.

[12]Parmegiani L，Cognigni GE，Bernardi S，et al. "Physiologic ICSI"：hyaluronic acid (HA) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus，resulting in improvement of embryo quality[J]. Fertil Steril，2010，93：598-604.

[13]Mokánszki A，Tóthné EV，Bodnár B，et al. Is sperm hyaluronic acid binding ability predictive for clinical success of intracytoplasmic sperm injection：PICSI vs. ICSI?[J]. Syst Biol Reprod Med，2014，60：348-354.

[14]Parmegiani L，Cognigni GE，Ciampaglia W，et al. Efficiency of hyaluronic acid (HA) sperm selection[J]. J Assist Reprod Genet，2010，27：13-16.

[15]Huang MT，Kuo-Kuang Lee R，Lu CH，et al. The efficiency of conventional microscopic selection is comparable to the hyaluronic acid binding method in selecting spermatozoa for male infertility patients[J]. Taiwan J Obstet Gynecol，2015，54：48-53.

[16]Worrilow KC，Eid S，Woodhouse D，et al. Use of hyaluronan in the selection of sperm for intracytoplasmic sperm injection (ICSI)：significant improvement in clinical outcomes--multicenter，double-blinded and randomized controlled trial[J]. Hum Reprod，2013，28：306-314.

[17]Majumdar G，Majumdar A. A prospective randomized study to evaluate the effect of hyaluronic acid sperm selection on the intracytoplasmic sperm injection outcome of patients with unexplained infertility having normal semen parameters[J]. J Assist Reprod Genet，2013，30：1471-1475.

[18]Kheirollahi-Kouhestani M，Razavi S，Tavalaee M，et al. Selection of sperm based on combined density gradient and Zeta method may improve ICSI outcome[J]. Hum Reprod，2009，24：2409-2416.

[19]Ainsworth C，Nixon B，Aitken RJ. Development of a novel electrophoretic system for the isolation of human spermatozoa[J]. Hum Reprod，2005，20：2261-2270.

[20]Razavi SH，Nasr-Esfahani MH，Deemeh MR，et al. Evaluation of zeta and HA-binding methods for selection of spermatozoa with normal morphology，protamine content and DNA integrity[J]. Andrologia，2010，42：13-19.

[21]Zarei-Kheirabadi M，Shayegan Nia E，Tavalaee M，et al. Evaluation of ubiquitin and annexin V in sperm population selected based on density gradient centrifugation and zeta potential (DGC-Zeta)[J]. J Assist Reprod Genet，2012，29：365-371.

[22]Dirican EK，Ozgün OD，Akarsu S，et al. Clinical outcome of magnetic activated cell sorting of non-apoptotic spermatozoa before density gradient centrifugation for assisted reproduction[J]. J Assist Reprod Genet，2008，25：375-381.

[23]Tavalaee M，Deemeh MR，Arbabian M，et al. Density gradient centrifugation before or after magnetic-activated cell sorting：which technique is more useful for clinical sperm selection?[J]. J Assist Reprod Genet，2012，29：31-38.

[24]Zahedi A，Tavalaee M，Deemeh MR，et al. Zeta potential vs apoptotic marker：which is more suitable for ICSI sperm selection?[J]. J Assist Reprod Genet，2013，30：1181-1186.

[25]Baccetti B. Microscopical advances in assisted reproduction[J]. J Submicrosc Cytol Pathol，2004，36：333-339.

[26]Gianaroli L，Magli MC，Collodel G，et al. Sperm head’s birefringence：a new criterion for sperm selection[J]. Fertil Steril，2008，90：104-112.

[27]Lee DR，Lee JE，Yoon HS，et al. Induction of acrosome reaction in human spermatozoa accelerates the time of pronucleus formation of hamster oocytes after intracytoplasmic sperm injection[J]. Fertil Steril，1997，67：315-320.

[28]Katayama M，Koshida M，Miyake M. Fate of the acrosome in ooplasm in pigs after IVF and ICSI[J]. Hum Reprod，2002，17：2657-2664.

[29]Mansour RT，Serour MG，Abbas AM，et al. The impact of spermatozoa preincubation time and spontaneous acrosome reaction in intracytoplasmic sperm injection：a controlled randomized study[J]. Fertil Steril，2008，90：584-591.

[30]Gianaroli L，Magli MC，Ferraretti AP，et al. Birefringence characteristics in sperm heads allow for the selection of reacted spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection[J]. Fertil Steril，2010，93：807-813.

[31]Bartoov B，Berkovitz A，Eltes F，et al. Pregnancy rates are higher with intracytoplasmic morphologically selected sperm injection than with conventional intracytoplasmic injection[J]. Fertil Steril，2003，80：1413-1419.

[32]Shalom-Paz E，Anabusi S，Michaeli M，et al. Can intra cytoplasmatic morphologically selected sperm injection (IMSI) technique improve outcome in patients with repeated IVF-ICSI failure? a comparative study[J]. Gynecol Endocrinol，2015，31：247-251.

[33]Setti AS，Braga DP，Figueira RC，et al. Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection results in improved clinical outcomes in couples with previous ICSI failures or male factor infertility：a meta-analysis[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2014，183：96-103.

[34]Balaban B，Yakin K，Alatas C，et al. Clinical outcome of intracytoplasmic injection of spermatozoa morphologically selected under high magnification：a prospective randomized study[J/OL]. Reprod Biomed Online，2011，22：472-476.

[35]Setti AS，Braga DP，Figueira RC，et al. Poor-responder patients do not benefit from intracytoplasmic morphologically selected sperm injection[J]. J Assist Reprod Genet，2015，32：445-450.

[36]La Sala GB，Nicoli A，Fornaciari E，et al. Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection versus conventional intracytoplasmic sperm injection：a randomized controlled trial[J]. Reprod Biol Endocrinol，2015，13：97.

[编辑：郭永]

Research progress on advanced sperm selection techniques for intracytoplasmic sperm injection

LI Jie，ZHENG Juan，ZHOU Li-ming*

NingboWomen&Children’sHospital，Ningbo315012

With the development of assisted reproductive technology，intracytoplasmic sperm injection (ICSI) brings childbearing potential to many infertile couples. Sperm quality plays an important role in embryo development and ICSI outcome. Advanced sperm selection techniques can improve the selection of sperms which possess structural intact and high DNA integrity for fertilization. This review summarizes the influence of current sperm selection techniques to the outcome of ICSI，and provides some new ideas for the clinical application and further development of ICSI.

Intracytoplasmic sperm injection；Sperm selection；Assisted reproductive technologies

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.019

2015-11-21；

2016-01-11

宁波市自然科学基金(2011A610035)

李洁，女，宁波人，硕士，基础医学专业.(*

，Email：zhou.li.ming@163.com)