现代生物技术在植物病原菌检测中的应用

黄灿，陈沁（1.上海大学生命科学学院，上海200436；2.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，江苏苏州215163）



现代生物技术在植物病原菌检测中的应用

黄灿1，2，陈沁1，*
（1.上海大学生命科学学院，上海200436；2.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，江苏苏州215163）

植物病原菌根据形态观察的方法进行分类鉴定比较困难。综述了国内外关于现代生物技术在植物病原菌检测应用的最新成果，旨在促进我国植物病原菌研究的快速发展。

病原菌；现代生物技术；检测应用

近年来，随着现代生物学技术的发展，生物学、血清学以及分子生物学等多种检测方法应用于植物检疫工作，检疫手段不断得到补充和完善。在基层检疫部门，针对植物病原菌检测较多的采用形态学观察和PCR相结合的方法；在国境口岸检疫部门，实时荧光定量PCR已经得到了立项，并作为一种普遍的植物病原菌检测方法大量使用。与传统植物病原菌检测方法相比，现代生物学技术的应用可以大大提高检测的准确性和灵敏度，尤其是免疫学检测技术和红外光谱检测技术的发展，使高通量并快速检测样本成为可能。但由于试剂、设备及方法的局限，这些高效灵敏的检测方法仍然得不到普及。

1　常规分离鉴定方法

根据形态学和生理生化特征来鉴定菌落是最简单也最早鉴定病原菌的方法。一些新发现的病菌由于未及时建立有效的检测措施，也采用形态观察的方法［1］。这种方法完成一次检验需要一周甚至数周时间，无法满足生产要求。结果一般用于初步判断。

聚合酶链式反应（PCR）是最常见的植物核酸检测技术。经过这些年的发展，植物病害的多样性及复杂性使得常规PCR技术难以满足。PCR技术本身的快速发展，为病原菌的检测提供了更多的选择。如巢式PCR是用两套引物扩增完整片段的变异PCR方法。烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、玉米细菌性枯萎病菌（Erwinia stewartii）、琯溪蜜柚黑斑病菌（Phyllosticta citriasiana）、红掌细菌性疫病菌（Xanthomonas campestris）、西瓜种子中的细菌性果斑病菌（Pseuomonas pseudoalcaligenes）、水稻中的稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）、芒果中的炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioiles）、甘蔗中的宿根矮化病菌（Leifsonia xyli）和黄化植原体（phytop lasma）、进境果实中的梨火疫病菌（Erwinia amylovory）和玉米内州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis）等都建立了相应巢式PCR检测体系［2-13］。在植物病菌检疫方面，巢式PCR灵敏度比常规PCR高100倍。该项技术已经十分成熟，目前市场上已经开发出相应的试剂盒，提高了使用的便捷性。

2000年开始，实时荧光定量PCR用于植物病原真菌方面［14-23］，实时荧光PCR逐步发展出了与Taqman探针相结合的技术。在体系中加入一个荧光标记探针，探针产生的荧光属于积累荧光，使得荧光信号强度与扩增产物成直接比例关系，为香梨黑斑病和红枣植物病害病原菌的快速检测提供了技术保障［24-25］。但该探针标记成本较高，不便普及应用。与Taqman探针工作原理相同的有Allglo探针和LNA探针等，这些探针成本较低，在植物检测领域有很大的应用前景。

溴化乙锭（EB）是一种高度灵敏的核酸染色剂，广泛应用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。EB具有致癌性，能嵌入碱基分子，导致错配，限制了它的使用范围。寻找其他可以替代的核酸染料是必要的。Kang等［26］使用SYBR Green I结合荧光实时定量PCR的 方 法检 测 水 稻 白 叶 枯 病 菌（Xanthomonas campestris），灵敏度高于EB染色法25倍～100倍，且不具有毒性，可以替代EB作为各种核酸电泳的染色剂。此外，普通染料难以渗透微生物孢子，影响与DNA的结合，Rawsthorn等［27］用叠氮溴化丙锭（PMA）对分离出的细菌孢子进行染色，成功检测出枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。冯建军等［28］利用PMA与实时荧光定量PCR相结合的方法，有效的抑制了混合体系中死细胞DNA的扩增，为检测榆木种子中细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii）活细胞提供了一种方便、快捷的新方法。市场上，核酸染料的种类越来越多，在应用上，必须根据实际检测的需要，选择合适的染料。

2　核酸检测方法

2.1多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）又称复合PCR，指在同一反应体系中加入二对及以上的引物，同时扩增多个核酸片段。理论上，只要引物和反应体系设计合理就可以同时检测出若干个基因，具有高效性、系统性和经济简便性的特点。在引物设计过程中，要防止不同引物组相互配对，形成二聚体或发卡结构，所以通常选择与退火温度相近的引物组。张丽芳等［29］通过优化引物和模板浓度，摸索扩增参数，建立了能同时检测烟草青枯病、黑胫病和猝倒病的多重PCR反应体系。此外，Pothier等［30］用多重PCR结合DNA斑点杂交的方法从176个黄藤种桃样品中检测出了核果树细菌性斑点病菌（Xanthomonas arboricola），灵敏度高达400 U。这种可以用于不同病原菌的大规模扩增方法，弥补了单纯PCR反应工作量大、费时费力的缺点，但是体系的退火温度需要反复摸索，在体系中存在多对基因或引物时，反应灵敏度会大大降低。PCR技术与其它相关检测手段的联合使用，是发挥稳定性和特异性的新方向。未来开发的重点应是联合新技术的开发和优化，使检测范围进一步扩大，进而适合基层检测应用。

2.2基因芯片技术

在当前的数据时代大背景下，企业人力资源管理的观念势必是要进行更新的。对于传统的思想观念进行更新，是时代发展的必然要求。其中，企业可对于相关工作人员进行系统性的培训，使得企业内部的员工接受新知识、掌握新能力［4］。另外，对于企业人力资源管理观念的更新，并非是摒除一切传统的思想管理观念，而是在此基础上进行更新发展，既要牢记传统观念下的精华部分，又要适应新时代的发展，尽心创新进步，也就是常说的“吸其精华，去其糟粕”，这句名言对于企业人力资源管理方面的应用颇为适用。

基因芯片是用点样法固定在玻璃板上的DNA探针微阵列，发展于20世纪90年代。当带有荧光标记的靶基因与基因组DNA芯片进行杂交产生互补匹配的序列时，荧光显影会对杂交信号强度进行测试，计算机软件综合比较与分析后可获得大量的基因表达信息［31］。龙海等［32］用荧光标记的PCR扩增后，与基因芯片上的探针进行杂交，可以区分3种检疫性黄单胞菌（Xanthomonas Campestris）。罗焕亮等［33］通过分析比对11种检疫性植原体的16SrRNA序列，设计出通用引物和特异性探针，建立了植原体（phytop lasma）基因芯片检测技术，实现了高通量检测植原体病原的方法。基因芯片主要特点是高通量、微型化和自动化，可以在1 cm2的载体表面固定数以万计探针分子，同步快速地全自动分析信息，在全基因组水平进行系统宏观的检测研究。基因芯片技术虽然有很多优点，但是存在检测成本高、设计要求较为严格等局限性，所以不能在基层单位的植物病原菌检测工作中得到广泛使用。

2.3环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种由日本科学家在2000年开发的核酸恒温扩增方法。该方法针对靶标序列的6个区域设计4条引物，利用链取代反应在等温条件下孵化，扩增过程会产生副产物焦磷酸镁，通过肉眼观察荧光的生成就可判断结果。在实践应用中，利用恒温箱和水浴锅，一步就可完成对目的基因的确定。目前在人兽共患的病原微生物中使用较多，在植物病原菌中鲜有报道［34］。汪万春等［35］用LAMP软件在线设计引物，建立的针对马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganense）检测方法，灵敏度达150 CFU/mL。袁钧等［36］根据玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii）基因组DNA的保守区域，设计出LAMP引物，该检测体系的灵敏度达到了45 CFU/mL。但是该方法也存在一些弱点和技术问题，如引物设计复杂，扩增产物不易验证等。由于灵敏度高、检测时间短、且不需要专门设备等优点，LAMP在我国基层检验部门中将越来越普及。

3　免疫学检测方法

3.1酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术（ELISA）是利用可溶性抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，通过抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量的检测方法，也是目前植物细菌病害诊断上应用比较广的一种免疫学方法，多用来检测马铃薯帚顶病和韭菜黄色斑纹病等［37-38］。免疫血清制备耗时耗力，可能存在交叉反应，造成假阳性。

近几年，ELISA反应得到优化，发展出双抗体夹心法（DAS-ELISA）、间接法、竞争法等。其中夹心法主要用于检测大分子抗原，间接法用于测定特异抗体，竞争法用于检测小分子抗原。在植物病原检疫中，前两种方法的应用较为普遍。乔宁等［39］把纯化的番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白作为抗原使家兔产生免疫反应，制备出了对应的多克隆抗体作为包被抗体，并用碱性磷酸酶对抗体进行标记作为酶标抗体，建立了番茄黄化曲叶病毒的DAS-ELISA。周丽洪等［40］也用同样的方法制备出家兔免疫抗体血清，再用间接ELISA诊断出丽格海棠细菌性叶斑病。DAS-ELISA和间接ELISA对于诊断植物病原体具有特异性强、灵敏度高的特点，但是耗时较长，免疫过程中的每个环节都会影响它的特异性和敏感度，探索反应的最佳条件、简化步骤和降低费用，是实现标准化和规模化应用的必经之路。

3.2PCR-ELISA

这是将PCR和ELISA两种技术结合在一起的方法。将寡核苷酸共价交联在PCR管壁上，用传统PCR方法经过扩增、洗涤后，把交联在管壁上的扩增产物作为固相产物进行ELISA反应，把洗涤液中的少量扩增产物作为液相产物，进行凝胶电泳或核酸杂交。Block等［41］用酶联免疫和实时荧光PCR的方法结合在一起，对玉米青枯病样本进行了鉴定试验，建立了酶联免疫捕捉-实时定量PCR检测体系，大大提高了检测灵敏度。陈曦等［42］用PCR—ELISA检测玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii）和玉米内州萎焉病菌（Clavibacter michiganensis），只用8 h就检测出了两种病菌，其灵敏度比普通PCR方法高出100倍。但是该方法操作较为繁琐，而且同批样本产物之间的交叉污染程度远远大于ELISA。PCR-ELISA是一种适合推广的综合检测方法，其将越来越受到海关等检疫部门的重视。优化PCR-EL ISA技术体系，使之稳定、易操作是今后研究的主要方向。

3.3微球免疫分析

微球免疫分析（xMAP）的技术原理是把不同待测物的抗体分子或基因探针以共价交联的方式结合到特定的荧光编码微球上，加入待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应，微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光来判定荧光编码和荧光强度，从而达到快速准确的定量目的。目前xMAP已成为一种替代的微生物检测方法。这种技术多用来分析食源性致病菌、毒素［43］和潜在的临床诊断的生物标志物［44-45］。到目前为止，用xMAP技术检测植物病原菌，只有为数不多的几例报道［46-47］，且都是针对植物病毒的检测。xMAP技术不需要繁琐的DNA提取和纯化步骤，具有其他分离方法难以比拟的操作简便、分离迅速完全的特点，属于新的病原菌分离鉴定方法，有广阔的开发应用前景。xMAP技术与荧光定量PCR、ELISA和免疫荧光显微术等相结合，还能实现特殊的检测目的，为植物病原菌的检测提供更加高效的手段。

4　红外光谱技术

傅立叶变换红外光谱（FTIR）检测技术利用分子振动能级的变化来鉴定分子中存在的官能团。近年来，由于红外光谱法能在样品非破坏情况下准确反映生物大分子甚至分子基因的变化，在食源性致病菌检测鉴定中大量使用。微生物种类的差别在FTIR图谱上主要表现为峰形、峰的数量、峰位及特定峰的相对强度上，准确度较高。李小龙等［48］对150片小麦叶片进行红外扫描处理后，鉴定出了小麦条锈病和叶锈病；徐晓鸥等［49］只用2 h左右，从豌豆和菜豆中同时检测出了细菌性疫病，且光谱结果的特异性强。Thaitrong等［50］建立了用FTIR法鉴定西瓜果斑病菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）的两个亚种的技术。同样的方法，可以用来判断莴苣霜霉病和辣椒疫病的光谱信息［51-52］。柴阿丽等［53］通过比较正常叶片和病变叶片的光谱图，确定了3个黄瓜褐斑病敏感谱带，再结合峰面积值和系统聚类分析，可以用作早期黄褐病的鉴定。

这些年，随着近红外光谱仪器和化学计量学软件的发展，近红外光谱分析技术已逐渐应用到对各种水果的无损检测中。通过该技术得到的光谱数据含有噪声，需要进行去噪处理，来提高模型稳定性和预测结果的准确性。运用光谱数据去噪法的漫投射光纤探头对马铃薯块茎进行检测，内部品质信息被光谱仪吸收并转化为数据就能显示在计算机上，判断马铃薯是否遭受病害［54］。该方法操作简单，且不破坏植物样本的组织，但对设备依赖性很大。在国内，该项工作刚刚起步，研究较少，还停留在实验室阶段，有待更深入的研究。

5　其他方法

随着科学技术的发展，植物病原体的检测手段也越来越多。色谱技术、菌体脂肪酸分析系统等都可以用作植物病原菌检测，但由于操作繁琐、实用性不强等特点，对植物病原菌的研究一直比较少。二代测序技术的发展使得基因检测具有高通量、高效性以及很强的实用性，Qinhua等［55］用焦磷酸测序法检测野油菜黄单胞菌叶斑病，数分钟就可获得大量信息，但其所依赖的焦磷酸测序仪价格极其昂贵，并非一般实验室所能配备。

此外纳米技术在提取核酸的过程中逐渐显示出良好的特点。连海燕等［56］建立了一种以纳米磁珠提取核酸为基础，同时结合RT-PCR/RT-qPCR技术检测植物类病毒的方法。磁性纳米材料比表面积大、容易修饰，具有可操作性。以纳米磁珠为载体，提取的核酸质量高。该方法具有操作简单、重复性好、稳定性高等优点。应用到出入境检疫系统中，对于提高检疫水平和相关农产品的进出口通过率有很重要的意义

6　结语

植物病原菌主要通过土壤、昆虫、植物体材料、空气等途径传播。目前较为实用的检测方法是病菌分离培养配合PCR鉴定，检测快速且成本低，但经常有漏检的情况发生，对不同病害的检测水平上也存在差异。近年来随着分子生物学、免疫学、光谱等技术的快速发展，尤其是几种学科的交叉研究，新的植物病原菌检测方法不断出现，在检测水平上体现出传统方法无可比拟的优点。然而这些方法在实际应用中受到技术、设备等的制约，需要在实验室进一步研究和优化，暂时不适合推广应用。在实际的检疫工作中，我们应该根据实际条件及检测样品的特点，选择合适的检测方法。随着现代生物学技术的广泛应用，植物病原菌检疫正朝着快速、高敏感性、高特异性、高通量及自动化的方向发展。

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Application of Modern Biological Methods in Detecting of Plant Phytopathogens

HUANG Can1，2，CHEN Qin1，*
（1.College of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200436，China；2.Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology，Chinese Academy of Sciences，Suzhou 215163，Jiangsu，China）

It is difficult for pathogenic bacterium to be classified and identified by the methods of morphological observation in plant.The new studies of detection methods for pathogenic bacterium during plant processing and storage were summarized in the paper.The purpose is to promote the rapid development of pathogenic bacteria of plant in our country.

pathogenic bacterium；modern biological technology；detection methods

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.051

黄灿（1989—），男（汉），硕士研究生，研究方向：生物抗病分子机制及病毒致病机理。

陈沁（1969—），女（汉），教授，博士，研究方向：农作物抗逆分子机制及植物与微生物互作关系。

2015-02-13