年龄及卵巢刺激对卵子利用率的影响

郑屹，王海青，周颖（温州医科大学附属第一医院 生殖医学中心，浙江 温州 325015）



年龄及卵巢刺激对卵子利用率的影响

郑屹，王海青，周颖
（温州医科大学附属第一医院 生殖医学中心，浙江 温州 325015）

[摘 要]目的：探讨不同年龄及卵巢刺激对周期活产率、每卵活产率和每活产所需的卵子数的影响。方法：回顾性分析2012年1月-2014年2月在我院生殖医学中心行卵胞浆内单精子注射（ICSI）的1 637个有移植周期的临床资料，按不同年龄或获成熟卵子个数不同分组，比较各组患者周期活产率、每卵活产率和每活产所需的卵子数，分析临床结局。结果：每个活产所需成熟卵子数以及每个成熟卵子的活产率显示卵子质量在23～37岁间相对稳定，37岁之后每卵活产率开始逐步下降，40岁之后显著下降，实现活产所需的卵子数目增加明显。卵巢反应性不同的3组比较发现，获成熟卵子数目多的组，周期累积活产率高，提示周期累积活产率可能与成熟卵子数量有关；每卵活产率与卵巢反应性呈负相关，成熟卵子数越多，每卵活产率越低（P＜0.01），每活产所需的卵子数越多（P＜0.01），提示过度卵巢刺激可能影响卵子质量。结论：估算实现不同年龄女性活产所需的卵母细胞数量对于妊娠结局的预测以及患者咨询的解答具有一定的指导意义，并可以为希望通过卵子冷冻进行生育力保存的妇女及本中心开展卵子冷冻项目提供参考数据。

[关键词]每卵活产率；周期活产率；卵胞浆内单精子注射；生育力保存

卵子冷冻可以用于接受手术或放化疗治疗后卵巢功能损伤的癌症患者的生育力保存，而且，该技术也是对于遗传性疾病需要预防性切除输卵管或卵巢；卵巢早衰；进行辅助生殖技术（assissted reproductive technologies，ART）治疗的患者取卵日夫方取精失败；以及那些渴望延长生育计划女性的一种有效实际的方法。由于目前冷冻保护剂的开发及运用，卵子冷冻的效果也越来越好[1-4]。因此在经过卵巢刺激后所获得的每个卵子是否可以有活产是患者和医师最为关心的。虽然每周期或每移植的活产率通常作为体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治疗结局的衡量指标，但这两个指标并不能很好地反映卵子和胚胎的生物学效力[5]。有研究表明，尽管经过促性腺激素（Gn）刺激一次手术取卵能获得多个卵子，但是大部分的卵子（＞95%）和移植胚胎（约85%）没有活产[6-7]。所以有两个更重要的概念：每个获得的成熟卵子的活产率（以下简称每卵活产率）和每活产所需的卵子数（即卵巢刺激后卵子的利用能效）[8-10]可能是一个ART结局的更相关指标，对卵子及胚胎的发育潜能更真实准确地评估。每个卵子的积累妊娠率可以为特殊的治疗对象提供临床决策[11]，其主要好处的报道是对于冷冻的价值，它可以为卵子及胚胎冷冻保存提供一个更新更准确的评价方法[12]。另外，年龄是影响妊娠率的最重要的因素[13-14]。随着年龄增加，女性自然妊娠率和辅助生殖临床妊娠率均下降，流产率增加，活产率降低，子代的染色体异常概率增加[15-16]，对于冷冻的卵子也是如此。因此，估算实现不同年龄女性活产切实所需的卵母细胞数量对于行ART治疗的患者是十分必要的。本研究对我院生殖医学中心以卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗方案接受IVF-ET治疗的不孕不育患者（共1 637个移植周期）进行回顾性分析，探讨成熟卵子的活产率与年龄以及不同卵巢刺激的关系，为以成熟卵子为基础的IVF-ET临床结局及卵子冷冻提供信息。

1 资料和方法

1.1一般资料 回顾性分析2012年1月-2014年2月来我院生殖医学中心行ICSI助孕治疗的不育症患者共1 637个周期的临床资料。入选标准：因男方因素行ICSI助孕治疗的周期。排除标准：①没有经过控制性超排卵的自然周期；②不成熟卵体外培养周期；③由于各种原因（卵巢过度刺激高风险、无胚胎移植、宫腔积液、患者主观因素等）行全胚冷冻而未移植胚胎的患者；④由于胚胎质量过差而取消移植的周期。这1 637个ICSI周期，总累积活产率为48.9%（801/1 637），总每卵活产率为6.04% （801/13 271），总体每活产所需的卵子数为16.6个（13 271/801）。患者年龄23～42岁，平均年龄（31.9±4.2）岁。由于小于23岁或高于42岁的有移植周期数量少于20例，且能够纳入研究的高于42岁的周期没有活产，所以将患者的年龄范围定在23～42岁。

1.2方法

1.2.1控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）方案：根据患者的年龄、基础窦卵泡数、基础性激素水平、是否合并子宫内膜异位症及既往周期等确定，包括常规长方案、短方案、超长方案、拮抗剂方案和微刺激方案等。冷冻胚胎移植采用自然周期或激素替代周期准备子宫内膜，移植当天复苏胚胎后30 min，选择解冻较好的胚胎移植。优质胚胎的标准及可冷冻或移植的胚胎标准均根据本中心胚胎实验室胚胎评分标准执行，胚胎实验室胚胎评分标准参照Gardner胚胎评分系统[17]。由于统计成熟卵子数对活产率的关系，所以选择进行ICSI治疗的周期。

1.2.2胚胎移植（embryo transfer，ET）及结果判定：35岁以下患者第1个周期移植2个胚胎，大于1个周期的移植3个胚胎；35岁以上患者移植3个胚胎；囊胚移植均为2个。ET后常规口服地屈孕酮（达芙通，上海苏威制药有限公司）每次10 mg，1 d 2次行黄体支持，并肌肉注射黄体酮针剂（浙江仙琚制药股份有限公司）每次60 mg，1 d 1次。2周后根据尿妊娠试验判断是否生化妊娠，4周后行B超检查可见孕囊和胎心搏动者确定为临床妊娠，10个月后追踪妊娠结局并记录婴儿出生情况。记录2组患者双胚妊娠情况。流产：是指妊娠不满28周，胎儿体质量不足1 000 g的胚胎或胎儿因各种原因脱离母体而排出体外，其中不满12周为早期流产（含生化妊娠），12～28周为晚期流产。

1.2.3观察指标：收集患者的基本病例资料，包括年龄、总获卵数、成熟卵子数、卵子成熟率（=总成熟卵子数/总获卵数）、累积活产例数、周期累积活产率（=该周期内所获胚胎行ET或冷冻胚胎移植后获活产例数/周期数，表示以周期为单位的累积活产率）、每卵活产率（=活产例数/成熟卵子个数）、每活产所需的卵子数（=成熟卵子数/活产数，表示实现一个活产所需的成熟卵子个数）、婴儿出生情况、双胎及多胎活产率。

1.3统计学处理方法 采用SPSS16.0软件进行数据

2 结果

2.1年龄相关的周期累积活产率、每卵活产率和每活产所需的卵子数比较 根据不同年龄统计各个年龄段的周期累积活产率、每卵活产率和每活产所需的卵子数发现，周期累积活产率随着年龄的增大而下降，40岁后急剧下降至＜10%；每卵活产率在34岁前随着年龄的增大而略有下降，35岁后活产率明显下降，38岁后急剧下降，从37岁的6.2%下降至38岁的4.4%，而42岁及以上＜1%；每活产所需的卵子数也有类似的变化规律，随着年龄的增大而每活产所需的卵子数目增加，40岁后急剧增加，由40岁前的＜30个增加至40岁后需＞80个。随着年龄的增加流产率增高（P＜0.01）；37岁后显著增高，双胎率总体差异无统计学意义（P＞0.05）；40岁后无双胎活产。所有周期均无三胎及以上出生。见表1、图1-2。

表1　不同年龄段周期累积活产率、每卵活产率和每活产所需的卵子数

图1　女性年龄分组的周期活产率

图2　女性年龄分组的每卵活产率

图3　女性年龄分组的每活产所需的卵子数

2.2不同卵巢反应的周期累积活产率、每卵活产率和每活产所需的卵子数比较 获成熟卵子数目不同的3组比较发现，成熟卵子数目越多的组，周期累积活产率越高，提示周期累积活产率可能与成熟卵子数量有关；每卵活产率与卵巢反应性呈负相关，成熟卵子数11个以上组每卵活产率最低（P＜0.01），每活产所需的卵子数最多（P＜0.01），提示过度卵巢刺激可能影响卵子质量。而且该组平均年龄最小（P＜0.01），双胎率最高（P＜0.01）。流产率3组间比较差异无统计学意义，但成熟卵子数11个以上组与获成熟卵子数目1～5个组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图4。

表2　不同成熟卵子数目各组的周期累积活产率、每卵活产率和每活产所需的卵子数

3 讨论

年龄是影响女性生育能力的重要因素，女性生育力从35岁开始明显减退，37岁后减退更迅速[13]。随着年龄增加，女性自然妊娠率和辅助生殖临床妊娠率均下降，流产率增加，活产率降低，生育子代的染色体异常概率增加[15-16]。近20年来，ART技术得到了广泛的发展和认可，尤其是IVF-ET助孕技术日臻成熟，妊娠率获得了很大提高。然而，年龄仍然是影响妊娠及IVF/ICSI结局的主要因素。在对ART的研究中，高龄对妊娠结局影响的研究很多。大多数学者认为女性年龄≥38岁，尤其是＞40岁时，IVF结局很差[18]，这与我们研究统计发现的不同年龄段的周期累积活产率随着年龄的增加而降低的结果相符。另外，我们的研究从23岁至42岁每个年龄段进行分析，数据显示每卵活产率在34岁之前随着年龄的增大而略有下降，35岁之后明显下降，38岁之后急剧下降，42岁以上低于1%；每活产所需的卵子数也有类似的变化规律，随着年龄的增大而增加，40岁之后急剧增加。说明卵子质量在23～37岁之间相对稳定，在38岁之后Gn刺激获得的卵子质量明显下降。这一发现与Faddy和Gosden于1995年发现的数学模型[19]在临床上是相符的，且卵巢组织切片也发现38岁之后小卵泡和闭锁卵泡显著增加。小于30岁女性的周期累积活产率总体下降，也存在波动，但每卵活产率的结果稳定，这可能与该年龄段的高获卵数和低新鲜胚胎移植有关。

第二个有趣的发现是获卵数对卵子生育潜能的影响以及Gn刺激对卵子利用率的影响。控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation，COS）技术的优点是可以使多个卵泡发育，获取多个卵母细胞，以补偿IVF-ET操作中由于各个环节导致卵子丢失，以及胚胎种植失败。获得的多个胚胎通过冷冻保存，可以进行多次胚胎移植，以提高妊娠机会，最终提高临床妊娠率。因此，COS已经成为ART中不可或缺的组成部分，但COS过程中使用超生理剂量的Gn导致超生理水平的雌激素可能会影响卵母细胞的质量，破坏卵子的发育调控和同步性，导致核质成熟的不同步，降低卵子的成熟率。高剂量的Gn注射可能会干扰卵母细胞的正常减数分裂、代谢及ATP产生，改变卵母细胞表观遗传学修饰，降低其发育潜能等，影响ART临床治疗结局，增加胎儿的安全风险[20]。

图4　不同卵巢反应性的周期累积活产率、每卵活产率比较

Meniru和Craft在1997年第一次发现每周期的妊娠率随着获卵数增加而升高，但是合适移植或冷冻的胚胎比例下降，他们认为可能是因为获卵数量过多造成的胚胎质量下降[21]。有学者运用核内荧光原位杂交证明了异倍体的形成与卵巢刺激和胚胎培养条件有关[22]。这与我们的发现是相符的，成熟卵子数目越多，周期累积活产率越高，但每卵活产率与卵巢反应性呈负相关，成熟卵子数越多，每卵活产率越低，每活产所需的卵子数越多，提示过度卵巢刺激可能影响卵子质量。

有研究表明，普通女性通过性交怀孕的概率为20%～30%，24岁年龄组的女性临床妊娠率约为30%[23]。在我们的研究中，经过卵巢刺激的相同年龄组的每个卵子活产率仅为6.04%，而以往研究显示，自然周期IVF每个卵子持续妊娠率为22.0%～23.2%。因此，我们认为卵巢刺激可能对卵子质量有决定性影响或卵巢刺激从卵巢中募集了可能会产生异常胚胎的闭锁卵泡。虽然获卵数低的女性有较高的每卵活产率，但1～5个获卵数组的女性平均年龄较高，我们认为卵巢低反应组也许是年龄较高，卵巢储备功能较差，而不是因为Gn用量少造成的获卵数目少，所以获卵数目少的低反应组反应了较差的卵巢保存力而可能不能说明温和的刺激方案会得到较高的每卵活产率。另一方面，卵巢高反应组中冷冻比例影响了新鲜胚胎移植，造成了每卵活产率较低。

虽然COS的发展使IVF周期活产率有所提高，但每卵活产率自1980年至今没有明显提高[8]，因此无论一次手术获卵多少，一次移植最多只能选择3枚胚胎，即使有一定数量的冷冻胚胎备选，患者也会经历心理和生理的失落与伤害，问题仍然存在于找到并识别“正确的卵母细胞”，得到发育潜能最高的胚胎，才能提高活产率。我们的研究仅通过对每个年龄段以及不同卵巢反应的数据统计，估计实现不同年龄女性一个活产所需的卵子数，但不同年龄女性的卵巢反应性不同，对Gn刺激的不同反应下的每卵活产率会如何，严格的胚胎挑选标准是否能发现发育潜能较高的胚胎，冷冻胚胎对每卵活产率的影响如何，这部分内容尝试在后续实验中继续增加样本量进行探讨。

23～37岁之间的女性每卵活产率和每活产所需的卵子数比较稳定，38岁之后每卵活产率显著下降，40岁之后急剧下降，实现活产所需的卵子数显著增加。我们的结果对以期通过卵子或胚胎冷冻进行生育力保存的妇女有参考价值。而且，考虑到采卵、冷冻卵子利用与临床应用之间的时间差，估算达到一个活产所需的成熟卵子数目是值得的，可以为本中心开展卵子冷冻项目提供数据支持，并且对不育症治疗的妊娠结局的预测以及患者咨询的解答有一定的指导意义。

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（本文编辑：吴彬）

The influence of age and ovarian stimulation on oocyte utilization

ZHENG Yi,WANG Haiqing,ZHOU Ying.Reproductive Medicine Center,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Abstract:Objective:To explore the effect of live birth per cycle,number of live births per mature oocyte and the number of mature oocytes per live birth according to ovarian ageing and ovarian response.Methods:A total of 1637 ICSI-ET cycles from January 2012 to February 2014 in Reproductive Medicine Center of the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College were retrospectively analyzed.Live birth per cycle,number of live births per mature oocyte and number of mature oocytes per live birth were further analysed in relation to the age or ovarian response.The clinical outcomes were compared.Results:The data presented in this study showed that the number of live births per mature oocyte and the number of oocytes per live birth remained remarkably stable between the age of 23 and 37 years.After the age of 37 years number of live births per mature oocyte began to decrease gradually but from 40 years of age it dropped dramatically,and the number of mature oocytes per live birth increased.On the other hand,the pregnancy rate per cycle increased with the number of retrieved oocytes,so the pregnancy rate per cycle was highly dependent on ovarian response.Compared between the three ovarian response group,number of live births per mature oocyte was lower (P<0.01) and the the number of oocytes per live birth was higher (P<0.01) in the response group with more mature oocytes,which indicated that the ovarian stimulation might affect the reproductive potential of the individual oocyte.Conclusion:These data are extremely valuable as they provide information on the expected outcome in women undergoing fertility preservation.Moreover,it is crucial in the prediction of IVF success and patient counseling and considering the launching oocyte freezing for fertility preservation in our center.

Key words:live birth per mature oocyte; live birth rate per cycle; intracytoplasmic sperm injection; fertility preservation

通信作者：周颖，教授，Email：zy-yin@163.com。

作者简介：郑屹（1986-），女，浙江温州人，硕士。

收稿日期：2015-04-24

[中图分类号]R321.1

[文献标志码]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.02.008