PSMA6基因rs1048990位点多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性分析

赵西耀，何芳梅（.浙江大学医学院附属第二医院建德分院 神经内科，浙江 杭州 3600；.西安医学院第一附属医院神经内科，陕西 西安 7003）



PSMA6基因rs1048990位点多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性分析

赵西耀1，何芳梅2
（1.浙江大学医学院附属第二医院建德分院 神经内科，浙江 杭州 311600；2.西安医学院第一附属医院神经内科，陕西 西安 710032）

[摘 要]目的：研究陕西汉族人群中蛋白酶体α6亚单位（PSMA6）基因rs1048990（-8C/G）位点的多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系。方法：采用病例对照研究，选择2012年1月至2013年12月在西安医学院第一附属医院神经内科住院的162例动脉粥样硬化性脑梗死患者（病例组）和同期159例健康体检者（对照组）。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测PSMA6基因rs1048990位点单核苷酸多态性，并分析其基因型及等位基因频率在脑梗死患者及正常人群中的分布特点。结果：与对照组比，病例组GG基因型频率差异无统计学意义（P=0.054），G等位基因频率差异亦无统计学意义（P=0.05）。分别依据有无高血压和糖尿病病史进行分层分析，病例组各基因型及等位基因频率间差异均无统计学意义（均P＞0.05），对照组亦如此。logistics回归分析发现，PSMA6基因rs1048990位点GG基因型在病例组和对照组间差异无统计学意义（P=0.059）。结论：PSMA6基因rs1048990位点可能与动脉粥样硬化性脑梗死发病不相关，但P值接近有统计学意义，值得进一步研究。

[关键词]蛋白酶体α6亚单位；单核苷酸多态性；动脉粥样硬化性脑梗死

脑梗死的一个重要原因是动脉粥样硬化，而后者是由一系列细胞和分子构成的炎症反应所致。目前许多研究提示炎症系统的基因多态性，蛋白酶体α6亚单位（proteasome subunit α type 6，PSMA6）rs1048990位点的突变，与高血压、糖尿病、冠心病及脑卒中相关[1-7]。本研究在陕西汉族人群中探讨PSMA6基因rs1048990位点的频率分布特点，并分析其基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性。

1 资料和方法

1.1一般资料 病例组为自2012年1月至2013年12月在西安医学院第一附属医院神经内科住院的动脉粥样硬化性脑梗死患者162例，病程在1周内，均为陕西汉族人。所有患者均经过临床及CT和/或MRI确诊（依照第四届全国脑血管病学术会议诊断标准），排除心脏源性脑栓塞（房颤、心瓣膜病、心肌梗死、二尖瓣脱垂、心脏黏液瘤）、腔隙性脑梗死动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等其他原因引起的脑梗死。对照组为同期该院健康体检者159例，均为陕西汉族人，均无脑卒中史，并经过临床检查和/或影像学检查排除脑卒中。收集所有研究对象的性别、年龄、烟酒史、既往病史等一般资料。糖尿病诊断标准为1999年世界卫生组织（WHO）规定的诊断标准，即空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L，和/或葡萄糖耐量试验（OGTT）2 h血糖≥11.1 mmol/L。高血压诊断标准按照2004年《中国高血压防治指南》公布的诊断标准[8]。吸烟者指一生中连续或累计吸烟6个月及以上者。所有标本的收集均经患者本人或其家属同意，并签署知情同意书，并经西安医学院医学研究伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1血样本的收集及全血DNA的提取：将所有入选者在清晨空腹条件下抽取静脉血5 mL，枸橼酸钠（3.8%）抗凝，用碘化钾法提取外周血白细胞的基因组DNA，在-20 ℃冰箱中保存备用。抽取肘静脉血3 mL，分离血清，采用ROCHE P800X2全自动生化分析仪测定血糖、血脂。

1.2.2聚合酶链反应引物及限制性内切酶的设计：引物设计及内切酶的选择参考贾立昕等[6]的研究，上游引物：5’-GAAGCAGTCGCTGCAACT-3’，下游引物：5’-ACCTGGTTCACTCACCTCATTG-3’，限制性核酸内切酶为RsaI。引物由上海生工合成。

1.2.3PSMA6基因rs1048990位点的基因型分型：PCR反应体系10.0 μL，其中包括基因组模板DNA 2.0 μL，2×PCR SuperMix 5.0 μL（由EasyTaq DNA聚合酶、dNTP和优化的反应缓冲液组成，由北京全式金生物技术有限公司提供），上游及下游引物（50 pmol/L）各0.08 μL，双蒸水2.84 μL。反应条件：94 ℃热变性5 min；94 ℃ 35 s，退火58 ℃ 34 s，延伸72 ℃ 30 s，扩增36个循环后延伸72 ℃ 10 min，终止反应。

PCR产物的限制性内切酶消化：酶切反应体系10 μL：PCR产物5 μL，10×NEBuffer 4 1.0 μL，10 000 U/mL限制性核酸内切酶RsaI 0.1 μL（由美国New England Biolabs公司提供），双蒸水3.9 μL，37 ℃水浴12 h。

8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：在酶切体系产物中加入2 μL 6×Loading Buffer，混合后全部上样，以1×TBE缓冲液为电泳液，在电压100 V下电泳约120 min，取下凝胶进行银染，观察结果并拍照，用透明薄膜封闭好，4 ℃保存。

1.3统计学处理方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计数资料采用t检验，以±s表示。基因型频率和等位基因频率采用基因计数法计算、Hardy-Weinburg平衡吻合度检测，等位基因和基因型频率比较采用x2检验，各变量与脑梗死的关系采用logistic回归分析进行检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.12组的一般资料比较 2组性别构成、年龄、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白差异均无统计学意义（均P＞0.05），高血压、糖尿病、血糖及吸烟在2组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2PSMA6基因rs1048990位点检测结果 rs1048990位点的扩增片段长度为185 bp，RsaI酶为此PCR片段的单位点内切酶，C/C基因型的扩增片段不存在酶切位点，将出现185 bp一条带；G/G基因型存在酶切位点，将出现98 bp和87 bp两条带；C/G基因型则产生185 bp、98 bp和87 bp三条带。PCR产物经酶切后的电泳结果见图1。

2.32组研究对象Hardy-Weinburg平衡检验 PSMA6基因rs1048990位点病例组基因型分布经x2检验符合Hardy-Weinburg平衡（x2=0.132245，P=0.716116）；对照组亦符合Hardy-Weinburg平衡（x2=1.847593，P=0.174064），表明该多态性位点的基因型分布在所研究人群中已达到了遗传平衡，样本具有群体代表性。

2.4PSMA6基因rs1048990位点的基因型及等位基因频率 病例组中G/G基因型频率为11.7%（19/ 162），对照组为5.7%（9/159），见表2。GG基因型频率2组比较差异无统计学意义（P=0.054），OR值为0.452（95%CI：0.198～1.031）；CC基因型频率2组比较差异无统计学意义（P=0.134）；G等位基因频率2组比较差异亦无统计学意义（P=0.05），OR值为0.716（95%CI：0.512～1.000）。在病例组中，依据有无高血压病史，对各基因型及等位基因频率进行比较，见表3。在病例组中，依据有无糖尿病病史，对各基因型及等位基因频率进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在对照组中，根据有无高血压、糖尿病进行分层，各基因型及等位基因频率间差异亦无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5logistic回归分析脑梗死患病因素 以脑梗死为因变量，脑梗死的危险因素为自变量进行logistic回归分析，结果发现PSMA6基因rs1048990位点GG基因型在2组中比较差异无统计学意义（OR值：0.452，95%CI：0.198～1.031，P=0.059），见表4。

表1　2组一般资料及卒中危险因素对比（±s）

表1　2组一般资料及卒中危险因素对比（±s）

与对照组比：aP＜0.05

类别　　病例组（n=162）　对照组（n=159）性别（男/女）　107/55　96/63年龄（岁）　67.40±8.70a　 66.50±8.10高血压[n（%）]　96（59.3）a　41（25.8）糖尿病[n（%）]　43（26.5）a　 9（ 5.7）血糖（mmol/L）　 6.49±2.58a　 5.23±1.89吸烟[n（%）]　51（31.5）a　24（15.1）胆固醇（mmol/L）　 5.20±2.13a　 4.92±0.98甘油三酯（mmol/L）　 1.52±0.93a　 1.32±0.22高密度脂蛋白（mmol/L）　 1.28±0.08a　 1.42±0.42低密度脂蛋白（mmol/L）　 3.88±1.02a　 3.49±0.92

图1　RsaI酶酶切PSMA6基因rs1048990位点扩增片段后产物电泳图

表2　2组研究对象PSMA6基因rs1048990位点基因型及等位基因频率比较[n（%）]

表3　有高血压与无高血压病史的病例组患者的基因型及等位基因频率比较[n（%）]

3 讨论

泛素-蛋白酶体系由26S蛋白酶体、泛素等成分组成。真核细胞内的26S蛋白酶体核心是一个20S的催化颗粒，由α环和β环组成。人类的PSMA6基因编码PSMA6，后者参与组成20S催化颗粒的α环。目的蛋白进入20S亚基核心内将被降解成低聚肽[7]，这在蛋白降解、细胞内通路（包括炎症通路）的调节中起重要作用[4-9]。

参与动脉粥样硬化形成的炎症因素在脑梗死的发病中起了重要作用。Freilinger等[10]对德国人群进行了研究，他们基于国际人类基因组单体型图计划数据，运用标签演绎法进行单核苷酸多态性的选择，首先对卒中患者进行TOAST分型后，运用MALDI-TOF质谱法进行基因分型，发现PSMA6基因rs1048990位点的多态性降低德国人总体缺血性卒中（OR：0.80，P=0.037）和大动脉粥样硬化性卒中（OR：0.70，P=0.042）的风险。Savchuk等[11]对102例乌克兰缺血性卒中患者和92例对照者，运用实时PCR方法，进行PSMA6（rs1048990位点）的基因型分型，发现PSMA6-8G/G突变体与复发性缺血性卒中相关。Heckman等[1]对20个先前报道与心肌梗死及冠心病相关的单核苷酸多态性位点在卒中患者中进行相关性检验，研究对象为患有缺血性卒中的713例白种人和166例非裔美国人以及825例对照者。将患者分为家族性白人亚组、缺血性卒中的遗传学研究白人亚组和非裔美国人缺血性卒中亚组，运用多元logistic回归分析模型的比值比进行分析，发现在家族性白人亚组中，惟一与缺血性卒中相关的单核苷酸多态性是PSMA6基因rs1048990位点（OR= 0.72，P=0.038），起保护性作用，也就是降低卒中风险，并且独立于传统危险因素。合并家族性和缺血性卒中的遗传学研究白人亚组中，仍然具有显著相关意义的位点是rs1048990（OR=0.80，P=0.036）。在例数较少（166例缺血性卒中和117例对照者）的非裔美国人中，独立于传统危险因素的相关位点仍是rs1048990（OR=0.31，P=0.020）。

但亦有研究得出相反的结论。Banerjee等[13]在北印度居民中，通过对176例卒中患者（112例缺血性卒中，64例出血性卒中）和212例对照者作为研究对象，运用PCR-RFPL的方法进行研究，在调整了混杂因素后，未发现PSMA6基因rs1048990位点多态性与脑卒中在基因型及等位基因频率上存在相关性。罗冬等[14]也发现PSMA6基因rs1048990位点多态性可能与中国湖南汉族人群脑卒中发病无关，且该多态性位点可能与各研究组的血压、空腹血糖及血脂代谢亦无关联。

本研究亦发现PSMA6基因rs1048990位点与陕西汉族人动脉粥样硬化性脑梗死无相关性。本实验对162例脑梗死患者和159例健康对照者PSMA6基因rs1048990位点进行检测，结果发现2组间GG基因型频率的差异无统计学意义（P=0.054），G等位基因频率的差异亦无统计学意义（P=0.05）。而依据有无高血压、糖尿病病史，分别对病例组、对照组进行分层分析，各基因型间及等位基因频率间均未发现差异有统计学意义。以脑梗死为因变量，脑梗死的危险因素为自变量进行logistic回归分析，发现PSMA6基因rs1048990位点GG基因型在病例组与对照组比较，差异无统计学意义（P=0.059），但P值接近有统计学意义，值得进一步研究。

目前关于PSMA6基因与脑梗死相关性的研究的结果不一致，分析其原因：①种族的差异，基因型及等位基因频率分布明显不同；②环境因素、研究对象选择标准等的差异或者基因多态性间的连锁不平衡作用所致；③研究的样本量不够大，导致统计学效度不足；④样本偏倚，如某些研究的病例分布不一定符合Hardy-Weinburg平衡规律。鉴于目前各研究中该相关性存在不一致性，需要进一步的研究来确定该基因变异对缺血性卒中及其亚型发病的作用。

表4　2组研究对象logistic回归分析结果

参考文献：

[1]HECKMAN M G,SOTO-ORTOLAZA A I,DIEHL N N,et al.Genetic variants associated with myocardial infarction in the PSMA6 gene and Chr9p21 are also associated with ischemic Stroke[J].Eur J Neurol,2013,20(2):300-308.

[2]BENNETT D A,XU P,CLARKE R,et al.The exon 1 -8C/ G SNP in the PSMA6 gene contributes only a small amount to the burden of myocardial infarction in 6946 cases and2720 controls from a United Kingdom population[J].Eur J Hum Genet,2008,16(4):480-486.

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[14]罗冬.湖南汉族人群PSMA6-8C/G多态性与脑卒中的相关性研究[J].医学信息,2013,26(7):301.

（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

·读者·作者·编者·

The correlative analysis of PSMA6 rs1048990 single-nucleotide polymorphism and artery atherosclerosis cerebral infarction

ZHAO Xiyao1,HE Fangmei2.1.Department of Neurology,the Second Affiliated Hospital,Jiande Branch,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou,311600; 2.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical College,Xi’an,710032

Abstract:Objective:To investigate the correlation between rs1048990(-8C/G) polymorphism of proteasome subunit alpha type 6(PSMA6) gene and artery atherosclerosis cerebral infarction in Han population of the Shanxi province in China.Methods:By using a case-control method,162 patients with artery atherosclerosis cerebral infarction (the case group) and 159 healthy controls over the same period (the control group) were selected in the study.The patients were in hospital of the department of neurology in the Affiliated Hospital of Xi’an Medical College from January 2012 to December 2013.The single nucleotide polymorphism of rs1048990 of PSMA6 gene was identified by the polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism(RFLP),and genotype and allele frequency distributions in cerebral infarction patients and healthy controls were analyzed.Results:Compared with the control group,the difference of the frequency of GG genetype in the the case group wasn’t significant (P=0.054),the difference of the frequency of G allele wasn’t significant,either (P=0.05).After stratified by suffering from high blood pressure and diabetes,respectively,we didn’t find significant differences among all genotypes and alleles in the case group (all P>0.05); the same result had been found in the control group,too.After adjustment for known cerebral vascular risk factors by logistic regression analysis,the GG genotype of rs1048990 revealed no statistical significance between the case group and the control group (P=0.059).Conclusion:The rs1048990 of PSMA6 gene mayn’t be associated with the artery atherosclerosis cerebral infarction.But the P value approximate statistical significance,the single nucleotide polymorphism is worth further researches.

Key words:proteasome subunit alpha type 6; single nucleotide polymorphism; artery atherosclerosis cerebral infarction

作者简介：赵西耀（1980-），男，河南开封人，主治医师，硕士。

基金项目：陕西省教育厅专项科研计划项目（2010JK803）。

收稿日期：2015-06-03

[中图分类号]R743.32

[文献标志码]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.02.005