肺癌患者外周血T-淋巴细胞亚群NK细胞的基线数值及其与预后的关系*

2016-04-08李月雅张翠翠魏熙胤王心悦李凯

中国肿瘤临床 2016年5期

李月雅张翠翠魏熙胤王心悦李凯

李月雅①张翠翠①魏熙胤②王心悦①李凯①

摘要目的：对比肺癌患者与健康者之间淋巴细胞亚群差异，评估肺癌患者外周血T淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞（NK）之基线值与预后的关系。方法：收集2006年2月至2013年3月就诊于天津医科大学肿瘤医院病例资料完整的肺癌患者105例，其中非小细胞肺癌（NSCLC）86例、小细胞肺癌（SCLC）19例，另选健康对照35例，对比接受治疗前肺癌患者和健康对照者外周血中的CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及NK细胞所占百分比，并回顾性分析86例NSCLC患者初治时外周血淋巴细胞亚群与预后的关系。结果：肺癌患者外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞及CD4/CD8比值均明显低于健康对照组（P=0.011，P=0.007，P＜0.001，P=0.025），而CD8+T细胞比例高于健康对照组（P=0.013）。当CD8+T≥31.8%及CD4/CD8＜1.28时NSCLC患者可以获得一个更长的OS（中位OS分别为36.2 m vs.20.0 m，P=0.010；30.8 m vs.20.0 m，P=0.035）。而CD3+T细胞、CD4+T细胞及NK细胞百分比对NSCLC患者预后无显著影响。结论：外周血CD8+T细胞基线水平较高的NSCLC患者生存较长，此基线水平可能对NSCLC患者预后有指示作用。

关键词肺癌非小细胞肺癌淋巴细胞亚群NK细胞CD4+T细胞CD8+T细胞CD4/CD8比值

*本文课题受国家科技重大专项（编号：2013ZX09303001）、天津市科委抗癌重大专项攻关计划（编号：12ZCDZSY15600）和CSCO研究基金项目（编号：Y-S2014-011）资助

Base amount of blood T-lymphocyte subsets and NK cells in patients with lung cancer and its value in predicting prognosis

Yueya LI1,Cuicui ZHANG1,Xiyin WEI2,Xinyue WANG1,Kai LI1
Correspondence to:Kai LI;E-mail:likai5@medmail.com.cn
1Departments of Thoracic Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Lung Cancer Diagnosis and Treatment Centre,Tianjin 300060,China;2Department of Public Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China
This study was supported by the National Science and Technology Major Project(No.2013ZX09303001),Tianjin Municipal Science and Technology Project(No.12ZCDZSY15600),and Chinese Society of Clinical Oncology(CSCO)Research Fund Project(No.Y-S2014-011)

Abstract Objective:To predict survival outcome,the lymphocyte subsets between lung cancer patients and healthy subjects was compared,and the significance of T-lymphocyte subgroups and NK cell base amount in the peripheral blood of lung cancer patients was evaluated.Methods:The percentage of CD3+T,CD4+T,CD8+T,and natural killer(NK)cells in the peripheral blood of 105 patients with lung cancer and 35 healthy subjects were analyzed by flow cytometry.Among the 105 patients,19 cases were small cell lung cancer(SCLC)and 86 cases were non-small cell lung cancer(NSCLC).The lymphocyte levels of the subgroups were recorded,and the relationship between lymphocyte subsets of 86 NSCLC patients and survival outcome was analyzed retrospectively.Results:The levels of CD3+,CD4+,NK cells and the ratio of CD4/CD8 in patients have respective P values of 0.011,0.007,＜0.001,0.025,which were significantly lower than that in normal subjects.However,the proportion of CD8+increased remarkably in patients(P=0.013).The overall survival(OS)was more longer when CD8+T were≥31.8% of NSCLC patients,and the ratio of CD4/CD8 were less than 1.28 of NSCLC patients(mean OS 36.2 m vs.20.0 m,P=0.010;30.8 m vs.20.0 m,P=0.035,respectively).However,the percentage of CD3+,CD4+,and NK cells had an insignificant effect in predicting the prognosis of NSCLC patients.Conclusion:High basal levels of CD8+T cells in peripheral blood could prolong the survival of patients with NSCLC.Furthermore,evaluating the basal levels of CD8+T cells by flow cytometry in peripheral blood might provide prognostic information.

Keywords:lung cancer,non-small cell lung cancer,lymphocyte subsets,NK cells,CD4-positive T-lymphocyte,CD8-positive T-lymphocyte,CD4-CD8 ratios

肺癌包括小细胞肺癌（SCLC）及非小细胞肺癌（NSCLC），以NSCLC为主（约85%）。近年研究表明，肺癌的发生、发展与免疫功能紊乱，尤其与T淋巴细胞亚群功能的紊乱息息相关［1］。T淋巴细胞主要包括CD4+T细胞及CD8+T细胞，在维持免疫系统平衡及发挥免疫功能中起重要作用。有报道证实肺癌患者外周血淋巴细胞亚群与健康对照相比存在紊乱［2］，而关于肺癌患者淋巴细胞亚群分布基线水平与预后关系研究却鲜有报道。本研究采用流式细胞术检测首诊肺癌患者外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK细胞百分比及CD4/CD8比值，并以健康成年人为对照，结合临床病理及随访资料进行分析。旨在阐明淋巴细胞亚群分布基线水平及其与肺癌患者预后的关系。

1材料与方法

1.1材料

选取2006年2月至2013年3月就诊于天津医科大学肿瘤医院病例资料完整的患者105例，均经病理学确诊为肺癌。血液检验前均未行放疗、化疗或手术治疗，并除外有严重感染性疾病、自身免疫性疾病及近期大剂量使用免疫抑制剂者。患者年龄41～81岁，中位年龄60岁；男性70例，女性35例；小细胞肺癌19例，非小细胞肺癌86例。非小细胞肺癌TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期10例，Ⅲ期22例，Ⅳ期40例。35例健康成年人作为对照组，均配对选自医院体检健康人群，年龄、性别分布与检测组无差异。对全部患者电话随访，截止日期为2015年6月27日，总生存期（OS）定义为确诊之日至患者死亡时间或最后一次随访时间。经医院伦理委员会批准，受试者或（和）其家属均知情本研究内容并签署知情同意书。

1.2方法

采用EPIC-XL型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司），对肺癌患者及健康体检者外周血中T细胞亚群及NK进行检测。小鼠抗人CD3/FITC、CD16+56/PE双标单克隆抗体和CD4/FITC、CD8/PE双标单克隆抗体及同型对照均购自美国贝克曼库尔特公司。

用EDTA-K2抗凝采血管采集受试者晨起空腹静脉血2 mL，室温放置。分别取100 μL抗凝外周血加入3个标记为1、2、3号的流式管内，于1号管内加入20 μL同型对照，2、3号管内均加入CD4/FITC、CD8/PE双标抗体和CD3/FITC、CD16+56/PE双标抗体各20 μL，室温避光孵育20 min；随后分别加入500 μL红细胞裂解液（美国贝克曼库尔特公司），室温避光15 min后各管均加入PBS缓冲液清洗3遍，1 500 rpm/min、5 min离心。最后，各管分别加入500 μL PBS缓冲液重悬，用流式细胞仪检测各部分细胞比例。CD3+T细胞定义为总T淋巴细胞，CD8+T细胞为CD3+CD8+T淋巴细胞，CD4+T细胞指CD3+、CD4+T淋巴细胞、CD3-、CD16+、CD56+T细胞定义为NK细胞。

所有入选患者后续均接受单纯化疗或化疗+放疗治疗。Ⅰ期患者14例，其中7例术后接受辅助化疗4个周期，其余7例为复发后进行化疗，复发时间为19～45个月。Ⅱ～ⅢA期患者20例均接受了标准术后4个周期辅助化疗，ⅢB～Ⅳ期患者52例均接受了标准化疗。化疗方案均为符合NCCN指南标准的含铂双药方案（包括紫杉醇+铂类、吉西他滨+铂类、长春瑞滨+铂类、培美曲塞+铂类等）；28例患者化疗至肿瘤稳定后接受胸部立体定向放疗，剂量为50 Gy/25次或60 Gy/30次。

1.3统计学方法

应用SPSS19.0软件进行统计学分析，检测数据用x±s表示。计数资料采用独立样本t检验和单因素方差分析。单因素生存分析采用Kaplan-Meier法分析，并进行Log-rank显著性检验。单因素生存分析结果采用Cox回归模型进行多因素生存分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1肺癌患者外周血淋巴细胞亚群分布比较

与健康对照组相比，肺癌患者外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞比例均较健康对照组下降，差异具有统计学意义（P=0.011，P=0.007，P＜0.001）；而CD8+T细胞百分比较对照组升高，差异具有统计学意义（P=0.013）；CD4/CD8较对照组亦有明显下降（P=0.025）。分层分析发现，NSCLC患者CD4+T细胞比例及CD4/CD8比值与健康对照组比较差异具有统计学意义（P=0.021，P=0.047），SCLC仅CD4/CD8比值与对照给比较差异具有统计学意义（P=0.048，表1）。

2.2 NSCLC患者淋巴细胞亚群与临床、病理特征间的关系

由表1提示NSCLC患者可能存在更明显的免疫功能紊乱，因此对其基线淋巴细胞亚群及病理特征进一步分析，结果显示男性患者CD3+T细胞比例高于女性（P=0.007），吸烟患者NK细胞比例高于不吸烟者（P=0.041）；而不同年龄、病理类型、TNM分期及有无淋巴结转移或远处转移患者的淋巴细胞亚群间差异均无统计学意义（表2）。

表1　不同病理类型肺癌及对照组外周血淋巴细胞亚群分布情况Table 1 Distribution of peripheral blood lymphocyte subsets in different pathological types of lung cancer and control group

表2　NSCLC患者淋巴细胞亚群比例与临床病理特征的关系Table 2 The relationship between the proportion of lymphocyte subsets and clinical pathological characteristics in NSCLC patients

2.3淋巴细胞亚群比例与NSCLC预后

2.3.1 NSCLC患者Kaplan-Meier单因素生存分析对各种因素进行Kaplan-Meier单因素生存分析，结果显示确诊时无淋巴结（48.1 m vs.20.4 m，P=0.001）及远处转移（38.9 m vs.17.1 m,P=0.001）、Ⅰ～ⅢA期(47.7 m vs.18.5m,P＜0.001)、接受手术、CD8+T细胞≥31.8%（36.2mvs.20.0 m，P=0.010，图1）及CD4/CD8比值＜1.28（30.8 m vs.20.0 m，P=0.035，图2）者可以获得更长的OS，但CD3+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞比例，以及性别、年龄、是否吸烟、病理类型及除手术治疗外的后续放、化疗对患者OS的影响均无显著意义（表3）。

图1　CD8+T比例与NSCLC患者预后Figure 1　 Relationship between the percentage of CD8+T and the prognosis of NSCLC patients

图2　CD4/CD8比值与NSCLC患者预后Figure 2 Relationship between the ratio of CD4/CD8 and the prognosis of NSCLC patients

表3　NSCLC患者的Kaplan-Meier单因素生存分析Table 3 The Kaplan-Meier univariate survival analysis of NSCLC patients

2.3.2 NSCLC患者Cox多因素生存分析将有无淋巴结转移及远处转移、TNM分期、是否手术、CD8+T细胞比例及CD4/CD8比值等Kaplan-Meier单因素生存分析所得结果输入Cox比例回归风险模型进行多因素生存分析，结果显示TNM分期及CD8+T细胞比例为影响NSCLC患者预后的独立影响因素（HR=2.544、P＜0.001，HR=1.932、P=0.009）。

表3　NSCLC患者的Kaplan-Meier单因素生存分析（续表3）Table 3 The Kaplan-Meier univariate survival analysis of NSCLC patients

3　讨论

随着对免疫机制的深入研究，学者们发现肺癌的发生、发展与机体的免疫功能密切相关［3-5］。目前T淋巴细胞亚群及NK细胞已被广泛用于监测肿瘤的发展以及判断疗效和预后［6-7］。本研究采用流式细胞术检测尚未接受手术、化放疗及靶向药物治疗等，肺癌患者治疗前外周血淋巴细胞亚群分布之基线情况并与健康者对比，旨在阐明治疗前肺癌患者外周血淋巴细胞亚群分布的差异情况，并分析其与预后的关系。

3.1肺癌患者淋巴细胞亚群分布紊乱

CD3+T细胞代表总T淋巴细胞、反应宿主的细胞免疫的整体状态。CD4+T细胞主要为辅助性淋巴细胞，可分泌IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等免疫抑制因子，发挥抑制肿瘤生长及转移的功能。本研究发现肺癌患者CD3+T细胞、CD4+T细胞比例均较对照组下降（P=0.011、0.007），与熊佳时等［8］报道一致。Gane⁃san等［9］认为肺癌患者在多重抑制因素的作用下机体处于免疫抑制状态，这些抑制性因素可抑制CD4+T细胞的分化和成熟。因此，认为肺癌患者存在CD3+T细胞及CD4+T细胞枯竭的免疫功能低下状态。

CD8+T细胞受MHC-I类分子限制，可主要分化为细胞毒性T细胞（CTL）、直接杀伤肿瘤细胞。本研究中患者CD8+T细胞比例明显高于对照组、与熊佳时等［8］的报道一致，这可能意味着肺癌患者的免疫系统可能反应性地产生出更多的杀伤性淋巴细胞（CTL）。而罗君等［10］却发现患者外周血CD8+T细胞比例下降，并认为可归咎于肺癌患者CD8+T细胞表面特异性受体结构发生改变，使得效应T细胞无法正确识别并与靶点结合，反馈性造成CD8+T细胞比例下降，导致肿瘤细胞免疫逃逸。总之，CD8+T细胞比例变化情况较复杂，各家报道中尚无统一观点，需待进一步深入研究。而CD4+T细胞比例降低、CD8+T比例升高导致了本研究中CD4/CD8比值降低。

NK细胞无MHC限制性，不需要抗原致敏和抗体参与，可直接杀死肿瘤细胞，其降低意味着机体的非特异性免疫功能减弱。本研究显示肺癌患者NK细胞水平低于健康对照组，表明患者存在免疫功能受损，与魏熙胤等［2］的报道一致。

3.2 NSCLC患者淋巴细胞亚群与临床病理特征

本组中不同年龄、是否淋巴结及远处转移、不同病理类型和TNM分期患者间CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞等淋巴细胞亚群均无显著性差异，这与熊佳时等［8］报道不符。结果显示Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者CD3+T细胞、CD4+T细胞及NK细胞比例明显低于Ⅰ～Ⅱ期患者，而CD8+T细胞的比例高于Ⅰ～Ⅱ期患者，可能与本研究的病例样本量小、Ⅰ～Ⅱ期患者所占比例少有关。本研究中女性患者CD3+T细胞比例低于男性患者、吸烟患者NK细胞比例高于不吸烟患者，与魏熙胤等［2］的报道不符。结果显示性别、是否吸烟与淋巴亚群分布无显著性差异，可能与本研究纳入病例均为初诊患者，而其研究纳入患者并非全部为初诊有关，但原因尚待进一步深入研究。

3.3 T淋巴细胞变化可能与NSCLC患者预后相关

CD3抗原是成熟T淋巴细胞的特异性抗原，Ra⁃thore等［11］在多项研究基础上总结发现，CD3+T细胞高表达的口咽癌患者预后佳，而CD3+T细胞低水平的结肠癌及宫颈癌患者预后差。本研究却发现NSCLC患者外周血CD3+T细胞百分比与预后无关（25.9 m vs.27.0 m，P=0.428），可能是由于样本量小、且标本为外周血，不能完全等同于组织标本。NK细胞属于快速效应细胞、可以早期高效消灭肿瘤细胞，但本研究显示NK细胞对预后无显著影响（20.0 m vs.29.2 m，P= 0.229），这可能缘于本研究中患者的NK细胞比例更接近健康对照组产生的偏倚。

Hald等［12］发现，肿瘤组织基质内CD4/CD8下降是导致NSCLC患者不良预后的独立影响因素，Zhang等［13］亦发现NSCLC患者的CD4/CD8比值越低、转移复发率越高。本研究却发现当CD4/CD8＜1.28时NSCLC患者OS得以延长（30.8 m vs.20.0 m，P= 0.035），这可能因为CD4/CD8的降低系因CD4+T细胞比例下降及CD8+T细胞比例升高的共同作用。那么上述OS延长到底因何造成，Rathore等［11］研究发现乳腺癌组织内高表达CD4+T细胞患者预后佳、低表达患者预后差；而燕翔等［14］Meta分析却发现CD4+T细胞表达水平与NSCLC患者OS、DFS均无关。在本研究中亦发现NSCLC患者外周血CD4+T细胞表达水平应与预后无关（25.8 m vs.27.0 m，P=0.992）。因此，推测CD4+T细胞水平降低可能不是延长患者生存的主要因素。新近研究表明，CD8+T细胞并非均一细胞群，根据其细胞表面CD28抗原表达可再分为CD8+CD28-T细胞（抑制性T细胞，Ts）和CD8+CD28+T细胞（活化细胞毒性T细胞，CTL）。CD8+CD28-T细胞具有免疫抑制功能，可抑制CTL细胞毒活性、并抑制T细胞增殖［15］。CD8+CD28+T细胞是获得性免疫的主要效应细胞之一，在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用［16］。有研究发现CD8+T细胞显著增高时，其识别和杀伤肿瘤细胞功能反被削弱，这是因为此时CD8+T细胞比例增加主要是Ts增加所致，而Ts长期升高进一步可使CTL消耗性减少，最终导致机体免疫系统对新出现的肿瘤细胞无应答［17］。Rathore等［11］却发现基质内浸润的CD8+T淋巴细胞可抑制肿瘤的生长，其高表达可以为乳腺癌患者带来明显的生存受益；Wahlin等［18］采用流式细胞术对淋巴结内CD8+T细胞进行检测，也发现淋巴结内CD8+T细胞高表达时患者预后更好。同样，本研究亦发现CD8+T细胞比例是NSCLC患者良好预后的独立影响因素，CD8+T细胞≥31.8%的患者OS更长。这些提示CD8+T细胞可能对OS有更大影响、其升高可能提示延长的OS。本研究中NSCLC患者外周血中升高的CD8+T细胞可能反映出患者对肿瘤的免疫反应，且其升高部分可能主要为能够抑制肿瘤增长的CD8+CD28+T细胞CTL亚群。故初诊时应同时检测NCSLC患者CD8+T细胞比例及其亚群分布情况，以帮助阐明CD8+T细胞及其亚群基线情况与预后的关系，为判断患者预后提供帮助。

综上所述，外周血CD8+T细胞基线水平升高可提示NSCLC患者的较长生存，这可能由于CD8+T细胞的抑癌亚群在其中占主导地位，利用流式细胞术检测外周血CD8+T细胞基线水平及其亚群分布可能对NSCLC患者预后有提示作用。而本研究仅为小样本量的回顾性分析，其结果值得以大样本量的前瞻性临床试验验证。另外，本研究提示除手术治疗外的后续放、化疗对患者OS的影响均无显著性差异，可能与入组例数较少，且其中晚期患者达60.46%（52/86）有关。

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（2015-12-03收稿）

（2016-02-12修回）

（编辑：杨红欣校对：张亻抿）