液相色谱串联质谱法检测有机肥中4种氟喹诺酮类抗菌药

饶钦雄，赵 晶，2，闵 红，邵 婷，4，孙明星，罗 峰，姚春霞

（1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海201403；2华东师范大学地理科学学院，上海200241；3上海出入境检验检疫局，上海200135；4安徽师范大学环境科学与工程学院，芜湖241003；5上海市崇明县动物疫病预防控制中心，上海202150）



液相色谱串联质谱法检测有机肥中4种氟喹诺酮类抗菌药

饶钦雄1，赵 晶1，2，闵 红3，邵 婷1，4，孙明星3，罗 峰5，姚春霞*

（1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海201403；2华东师范大学地理科学学院，上海200241；3上海出入境检验检疫局，上海200135；4安徽师范大学环境科学与工程学院，芜湖241003；5上海市崇明县动物疫病预防控制中心，上海202150）

摘 要：建立了有机肥中4种氟喹诺酮类抗菌药的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析方法。取5 g有机肥样品以5 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（pH＝4" 0）与20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V）超声提取两次，用HLB固相萃取柱进行净化富集，以5％氨化甲醇进行洗脱，氮气吹干后以溶液（三乙胺＋磷酸＋水＝0" 66＋0" 74＋100）＋乙腈＝88＋12（V/V）复溶。以0" 1％甲酸水和甲醇作为流动相，采用梯度洗脱方式LC-MS/MS检测。试验结果表明，有机肥中4种喹诺酮类化合物不同浓度加标回收率在66" 19％—115" 00％，相对标准偏差在2" 40％—9" 45％，检出限为0" 010 mg/kg，定量限为0" 050 mg/kg，本方法能够满足实际有机肥样品的测定要求。

关键词：有机肥；氟喹诺酮类；检测方法；液相色谱串联质谱；提取剂

氟喹诺酮类（Fluoroquinolones，FQs）作为一类人工合成高效、广谱抗菌药在规模化畜禽养殖中大量使用，但其基本不能被动物吸收，大部分以药物原形或其代谢物随粪尿排出，成为环境中抗菌药污染的重要来源［1］。污染的有机肥料广泛施用于农业生产中，影响土壤肥力、危及农产品质量安全［2］，还可通过地表径流和淋滤作用造成水体的污染，并引发细菌耐药性，进而威胁动物与人类健康；因此，这类抗菌药已成为重要环境有机污染物和环境科学研究的热点［3］。近年来，多数科研者已用高效液相色谱法进行有机肥中兽药残留的检测，就目前报道的方法而言，有机肥中兽药残留检测回收率较低，检测方法复杂［4-5］。本试验尝试用液相色谱串联质谱法同时检测有机肥中4种常见氟喹诺酮类抗菌药：诺氟沙（NOR）、环丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、恩诺沙星（ENR）。以期为有机肥中喹诺酮类的检测分析及风险评价提供参考依据。

1 材料与方法

1．1 试剂与仪器

样品的采集：样品为鸡粪和猪粪，按照GB/T 8571规定制备实验室样品。样品烘干研磨后过1 mm或2 mm试验筛。

药品和试剂：诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）、恩诺沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）标准品；Na2EDTAMcllvaline缓冲液（pH 4" 0）：0" 1 mol/L柠檬酸溶液∶0" 2 mol/L磷酸二氢钠溶液＝1000∶625（V/V）；复溶液：（三乙胺＋磷酸＋水＝0" 66＋0" 74＋100）（体积比）∶乙腈＝88∶12（V/V）；甲酸、甲醇、乙腈均为色谱纯。

主要仪器：液相色谱串联质谱（Thermo，Quantum Ultra）；固相萃取装置（WATERS）。亲水亲脂平衡萃取柱（HLB）（200 mg，6 mL）；离心机；超声仪；氮吹仪。

1．2 液相色谱串联质谱参考条件

液相色谱工作条件：C18柱（100 mm×3" 0 mm（i" d），2" 7 μm）；流动相：A相为0" 1％甲酸水溶液，B相为甲醇；梯度洗脱：梯度洗脱程序见表1；流速：0" 3 mL/min；柱温：40℃；进样量：5 μL。

表1　梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

质谱参考条件：离子源，电喷雾离子源；扫描方式，正离子扫描；检测方式，多反应监测；电离电压，4" 0 kV；源温，300℃；毛细管温度，350℃；辅气流速，20 L/h；鞘气流速，30 L/h；测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压、碰撞能量见表2。

表2　氟喹诺酮类抗菌药的定性定量离子及锥孔电压、碰撞能量Table 2 Qualitative and quantitative ions，cone voltage and collision energy of fluoroquinolones

1．3 样品前处理

称取（5" 0±0" 02）g试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaline缓冲液（pH 4" 0），涡动混匀，再加入20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V），涡动2 min，超声10 min。4 500 r/min离心10 min，转移上清液至50 mL容量瓶中，残渣再加入上述提取剂重复提取1次。合并两次提取液，用乙腈定容至刻度，摇匀。准确量取10 mL提取液，置于50℃水浴中氮气吹至液面低于0" 5 mL（不能吹干），再加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaline缓冲液（pH 4" 0）混匀待净化。

HLB固相萃取柱使用前用5 mL甲醇和5 mL纯水活化，将上述待净化液以2—3 mL/min的速度过柱，弃去滤液，用6 mL 30％甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干（5—10 min），再用6 mL 5％氨化甲醇洗脱，并收集洗脱液氮气吹干，用1 mL复溶液溶解，涡动混匀，过0" 22 μm滤膜待测。

2 结果与分析

2．1 色谱分析图

在本研究建立的仪器条件下，4种氟喹诺酮类标准品的色谱峰十分尖锐（图1—4），并且均在4 min内完成出峰，说明构建的LC-MS/MS检测方法能同时较好地检测出4种氟喹诺酮类抗菌药。

图1　诺氟沙星色谱图Fig．1 Chromatogram of norfloxacin

图2　氧氟沙星色谱图Fig．2 Chromatogram of ofloxacin

图3　环丙沙星色谱图Fig．3 Chromatogram of ciprofloxacin

图4　恩诺沙星色谱图Fig．4 Chromatogram of enrofloxacin

2．2 提取剂的选择

比较了4种提取剂A：Na2EDTA-Mcllvaine（25 mL），B：乙腈＋乙酸＝9＋1（V/V，25 mL），C：乙腈溶液（含1％草酸）（25 mL），D：A＋B混合液（5 mL＋20 mL），提取有机肥中氟喹诺酮类抗菌药的加标回收率（表3）。结果显示D方案加5 mL Na2EDTA-Mcllvaine浸润，后加20 mL乙腈＋乙酸＝9＋1（V/V）两次重复提取有机肥中氟喹诺酮时，4种物质的回收率均能达到80％左右，并且重现性较好。故本试验最终采用D作为有机肥中4种氟喹诺酮类抗菌药的最佳提取剂。

2．3 线性范围及检出限

配制质量浓度为0"010 μg/mL、0"025 μg/mL、0"050 μg/mL、0"100 μg/mL、0"150 μg/mL及0"250 μg/mL的系列基质匹配标准溶液，液相色谱-串联质谱仪测定。以定量离子的峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线，氧氟沙星标准曲线：Y＝7587" 19X，R2＝0" 9999；诺氟沙星标准曲线：Y＝635" 51X，R2＝0" 9999；环丙沙星标准曲线：Y＝3317" 49X，R2＝0" 9998；恩诺沙星标准曲线：Y＝6030" 96X，R2＝0" 9998。在空白有机肥中添加4种氟喹诺酮标准品，多次低水平添加，以3倍信噪比作为检出限，10倍信噪比作为定量限，结果显示4种氟喹诺酮化合物在有机肥中的检出限为0" 010 mg/kg （S/N≥3），定量限为0" 050 mg/kg。

表3　不同提取剂下有机肥中4种氟喹诺酮类抗菌药的回收率Table 3 Recovery rates of 4 fluoroquinolones in manure under different extractants

2．4 样品的加标回收率及准确度

取鸡粪及猪粪2种有机肥样品作为空白基质做添加回收试验。我国尚未对有机肥中氟喹诺酮类规定最高残留限量（MRL），但肉类食品中的MRL为0" 1—0" 3 mg/kg，以肉类食品的MRL为参考标准，设置了0" 1 mg/kg、0" 5 mg/kg、1" 0 mg/kg三个水平进行添加回收试验。在鸡粪和猪粪两种基质的有机肥中氟喹诺酮类化合物的平均回收率在66" 19％—115" 00％，相对标准偏差在2" 40％—9" 45％。

2．5 精密度

以空白有机肥试样作为基质，进行0" 1 mg/kg、0" 5 mg/kg和1" 0 mg/kg三个添加水平，每个水平重复5个样品，按照上述样品处理方式操作，按外标法计算回收率，以测定结果计算日内变异系数，3天内进行3批处理，以计算日间变异系数。结果表明在此方法下有机肥中喹诺酮类抗菌药的日内变异系数和日间变异系数均小于14％。

2．6 实际样品分析

市场上收集了9个有机肥样品，用建立的检测方法对其中喹诺酮类化合物含量进行检测（表4）。结果显示，在有机肥样品中，氟喹诺酮类药物均有残留。参照肉类中的氟喹诺酮类的最高残留量可知，1号和2号样品中诺氟沙星，3号样品中氧氟沙星，4号样品中除诺氟沙星外残留均很严重，超过MRL规定值，其余样品中4种氟喹诺酮类抗菌药均小于0" 3 mg/kg，但仍有残留，说明该方法能有效用于检测有机肥中氟喹诺酮类的残留。

表4　有机肥样品中4种氟喹诺酮类残留含量Table 4 Contents of four fluoroquinolones in manure samples　mg·kg－1

3 讨论与结论

本研究建立了LC-MS/MS测定有机肥中4种氟喹诺酮类抗菌药的方法。以往研究多用液相色谱进行检测，如张敏等［6］运用高效液相色谱-荧光方法检测畜禽粪中4种氟喹诺酮类抗菌药残留，胡献刚等［7］运用固相萃取-高效液相色谱法测定畜牧粪便中13种抗生素药物残留，该方法也具有一定的稳定性和重现性，但本研究建立的检测方法前处理较之简单方便，且该法进样量少，灵敏度更高。用5 mL Na2EDTAMcllvaline和20 mL乙腈∶乙酸＝9∶1（V/V）溶液提取有机肥中残留目标物，得到较好的提取效果，HLB固相萃取柱净化，具有良好的净化效果。

通过对该方法回收率、精密度、准确度等的研究，表明该方法具有较高的准确度和精密度，可为定性和定量分析有机肥中氟喹诺酮类抗菌药提供一种准确、高效的检测方法。但该方法目前局限于4种氟喹诺酮类抗菌药的检测，对于其他种类兽药的检测尚不明确，可进一步探讨优化该方法用于检测其他兽药的残留。

参 考 文 献

［1］李彦文，莫测辉，赵娜，等"高效液相色谱法测定水和土壤中的磺胺类抗生素［J］"分析化学，2008，36（7）：954-958"

［2］吴小莲，向垒，莫测辉，等"超高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定蔬菜中喹诺酮类抗生素［J］"分析化学，2013，41（6）：876-881"

［3］邰义萍，莫测辉，李彦文，等"长期施用粪肥土壤中喹诺酮类抗生素的含量［J］"中国环境科学，2010，30（6）：328-332"

［4］王冉，刘铁铮，魏瑞成"猪粪便中兽药盐霉素残留的降解动态研究［J］"农业环境科学学报，2007，26（S1）：219-223"

［5］田野，刘善江"有机肥料中抗生素在农田土壤和植物间的迁移研究［J］"安徽农业科学，2012，40（8）：4523-4525"

［6］张敏，刘庆玉，敖永华"高效液相色谱-荧光检测畜禽粪污中四种氟喹诺酮类抗生素残留［J］"湖北农业科学，2012，51（3）：602-604"

［7］胡献刚，罗义，周启星，等"固相萃取-高效液相色谱法测定畜牧粪便中13种抗生素药物残留［J］"分析化学，2008，36（9）：1162-1166"

（责任编辑：程智强）

Determination of four fluoroquinolones in manure by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

RAO Qin-xiong1，ZHAO Jing1，2，MIN Hong3，SHAO Ting1，4，SUN Ming-xing3，LUO Feng5，YAO Chun-xia1*
（1Institute for Agro-Food Quality Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；2School of Geography，East China Normal University，Shanghai 200241，China；3Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China；4College of Environmental Science and Engineering，Anhui Normal University，Wuhu 241003，China；5Animal Epidemic Disease Control Center of Chongming County，Shanghai 202150，China）

Abstract：A method of determining 4 fluoroquinolones in manure was developed by liquid chromatographytandem mass spectrometry（LC-MS/MS）" A manure sample（5" 0 g DW）was ultrasonically extracted twice with 5-mL Na2EDTA-Mcllvaine buffer solution（pH 4" 0）and 20-mL acetonitrile/acetic acid（9/1，V/V），purified and concentrated by HLB solid-phase cartridge and then eluted with 5％ammoniated methanol" The residue was dissolved in the combined solution（triethylamine∶phosphoric acid∶water＝0" 66∶0" 74∶100，V/V/V）and acetonitrile at 88∶12 volumetric ratio after evaporated to dryness under a stream of nitrogen gas" With 0" 1％formic acid-containing water and methanol as mobile phases and via gradient elution，the analyte was determined by LC-MS/MS" The result showed that the recovery rates of 4 fluoroquinolones in different spiked manure samples were 66" 19％—115" 00％with a relative standard deviation of 2" 40％—9" 45％，and the detection limit and quantitation limit were 0" 010 mg/kg and 0" 050 mg/kg respectively，indicating that this method could meet the requirement for determining actual manure samples"

Key words：Organic fertilizer；Fluoroquinolones；Detection method；Liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Extractant

*通信作者：姚春霞（1976—），女，博士，副研究员，研究方向：土壤和农产品安全。E-mail：chunxia" yao＠163" com

作者简介：饶钦雄（1979—），男，硕士，助理研究员，研究方向：农产品安全。E-mail：qinxiongrao＠163" com

基金项目：国家质检公益性行业科研专项（201310269）；上海市自然科学基金（12ZR1420200）；上海市科委重点支撑项目（14DZ1206303）

收稿日期：2015-06-03

文章编号：1000-3924（2016）01-056-05

中图分类号：X713

文献标识码：A