分光光度法测定灵芝中总三萜含量方法探讨

张 忠，张劲松，2，3，刘艳芳，周 帅，王金艳，2，于华峥，3，唐庆九，2*

（1上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海201403；2上海海洋大学食品学院，上海201306；3上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）



分光光度法测定灵芝中总三萜含量方法探讨

张 忠1，张劲松1，2，3，刘艳芳1，周 帅1，王金艳1，2，于华峥1，3，唐庆九1，2*

（1上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海201403；2上海海洋大学食品学院，上海201306；3上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）

摘 要：分别运用分光光度法和HPLC法测定了灵芝子实体、菌丝体、孢子粉中三萜含量，发现不同方法所测得的含量差别较大。对不同的灵芝酸标准品及干扰物质油酸、麦角甾醇进行香草醛高氯酸的显色反应，发现不同的灵芝酸显色后最佳吸收波长在530—550 nm，在550 nm处的测定值相差很大，特别是灵芝中含量较高的灵芝酸A、B和C的测定值严重偏低，而干扰物质油酸和麦角甾醇对测定值具有严重的干扰。试验结果表明：采用分光光度法测定灵芝中总三萜的含量不能如实反应灵芝中总三萜的实际情况，不建议作为测定灵芝及其相关产品中总三萜含量的方法。

关键词：灵芝；三萜；分光光度法；HPLC

灵芝（Ganoderma lucidum）是我国传统的药用真菌，灵芝中含有多种化学成分，包括多糖、三萜、甾醇、生物碱等［1］。其中三萜类化合物是灵芝的主要活性成分之一，具有护肝排毒、抗氧化、抑制肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等药理活性［2-5］，因此三萜化合物含量的高低是灵芝产品品质的重要指标。

目前，灵芝及其产品中总三萜含量的定量检测还没有统一的国家标准；农业部在2001年颁布了检测灵芝及其相关产品中总三萜含量的备案标准（NY/SJ 339—2001）［6］；该标准主要是以齐墩果酸或熊果酸为对照品，以5％香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸为显色剂，用分光光度法测定灵芝中总三萜的含量。该标准所采用的方法是目前最常用的检测方法之一，但由于灵芝中干扰物质多，因此测定结果误差大，同时标准品齐墩果酸与灵芝中三萜成分结构差异较大，作为指标成分是否合适有待商榷。近年来，有很多学者对此方法进行了优化，如王红梅等［7］对标准溶液浓度、取样体积、显色剂的用量等方面进行优化来测定灵芝孢子粉中总三萜的含量；李保明等［8］选用灵芝中的成分灵芝酸B为对照品，采用比色法测定灵芝总三萜酸含量。

1 材料与方法

1．1 原料

灵芝子实体及孢子粉（菌株号G0109）来自浙江龙泉灵芝栽培基地；灵芝菌丝体为上海市农业科学院食用菌研究所菌株G0109液体发酵所得。

1．2 试剂与仪器

齐墩果酸（标准品），中国药品生物制品检定所；色谱级甲醇，美国迪马科技公司；分析纯无水乙醇、分析纯高氯酸、香草醛、冰醋酸，国药集团药业股份有限公司；油酸，sigma公司；灵芝酸A等标样由上海市农业科学院食用菌研究所提供（分离纯化所得，纯度大于99％）。

齐墩果酸标准溶液：精确称取干燥至恒重的齐墩果酸10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准溶液；5％香草醛-冰醋酸溶液：称取香草醛5 g，加入95 mL冰醋酸溶解即可。

离心机，德国Heraeus公司；超声波清洗器K1-250DE，昆山市超声仪器有限公司；Waters 600高效液相色谱仪（2996型二极管阵列检测器），美国Waters公司；安捷伦8453型紫外可见分光仪，美国安捷伦公司；Synergy HT96孔板酶标仪，Bio-TEK公司。

1．3 灵芝子实体、菌丝体、孢子粉样品液的制备

从那件事情以后我再也没有哭过，妈妈和弟弟说我终于像个男子汉了，我听后，心里甭提有多高兴了。（指导老师：孙玉巧）

样品灵芝子实体置于烘箱65℃干燥24 h后，经粉碎机粉碎成碎屑。分别准确称取200" 00 mg灵芝子实体碎屑、菌丝体、孢子粉、破壁孢子粉各3份置于50 mL离心管中，加入95％乙醇10 mL，充分混匀，静置6 h，室温超声30 min，过滤；滤渣再分别加入95％乙醇10 mL，充分混匀，静置6 h，室温超声30 min，过滤，合并滤液待用。

1．4 齐墩果酸标准曲线的绘制

参照农业部检测灵芝及其相关产品中总三萜含量的备案标准（NY/SJ 339—2001），准确吸取质量浓度为1 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL分别放入20 mL具塞磨口试管中，将试管置于沸水浴中蒸发去溶剂，然后在每个试管中加入0" 20 mL 5％香草醛-冰醋酸溶液和1"0 mL高氯酸，加塞摇匀。置于60℃水浴恒温加热20 min并移入冰水浴冷却3 min，再加入5" 0 mL冰醋酸，摇匀并置于室温，15 min后于550 nm处测定对照品溶液的吸光度值。以吸光度值为横坐标、齐墩果酸质量（μg）为纵坐标作图，得标准曲线。

1．5 分光光度法测定灵芝子实体、菌丝体、孢子粉中的总三萜含量

灵芝子实体、菌丝体、孢子粉样品液（1" 3所制备）参照1" 4方法测定吸光度值，对照齐墩果酸标准曲线，计算总三萜含量。

1．6 高效液相色谱法（HPLC）测定灵芝子实体、菌丝体、孢子粉中的三萜含量

1" 6" 1 高效液相色谱法（HPLC）的测定条件

参照文献［14］色谱条件，色谱柱为YMC ODS-A（250 mm×4" 6 mm），柱温30℃，5‰醋酸水（A）与甲醇（B）梯度洗脱：0 min，A：70％，B：30％；50 min，A：60％，B：40％；85 min，A：0％，B：100％；100 min，A：100％，B：0％；110 min，A：70％，B：30％；流速1" 0 mL/min，进样量10 μL，检测时间110 min，检测波长：3D波长扫描，210—400 nm。

1" 6" 2 对照品溶液的制备

准确称取1" 0 mg的灵芝酸A、B、C2、DM、S、T、灵芝酮三醇、灵芝醇B标准样品于2 mL离心管中，加入1" 0 mL甲醇（色谱纯）配成1" 0 mg/mL的对照品溶液待用。

1" 6" 3 HPLC法测定灵芝子实体、菌丝体、孢子粉中的三萜含量

参照1" 3方法制备灵芝子实体、菌丝体、孢子粉样品液，采用1" 6" 1方法测定其三萜含量。

1．7 灵芝酸A等8个标准品以及油酸和麦角甾醇最佳吸收波长的确定

准确吸取质量浓度为1 mg/mL的灵芝酸A、B、C2、DM、S、T、灵芝酮三醇、灵芝醇B标准样品溶液和油酸与麦角甾醇样品液各50 μL放入20 mL具塞磨口试管中，将试管置于沸水浴中蒸发去溶剂，分别加入0" 20 mL 5％香草醛-冰醋酸溶液和1" 0 mL高氯酸，加塞摇匀。置于60℃水浴恒温加热20 min并移入冰水浴冷却3 min，再加入5" 0 mL冰醋酸，摇匀并置于室温，15 min后用酶标仪于400—700 nm扫描测定对照品溶液的吸光度值。

2 结果与分析

2．1 分光光度法测定灵芝子实体、菌丝体、孢子粉中的总三萜含量

试验结果表明：灵芝破壁孢子粉中三萜含量最高，为1" 93％；灵芝子实体中三萜含量为1" 42％；菌丝体为0" 85％；孢子粉未破壁含量较低，为0" 04％。

2．2 HPLC法测定灵芝子实体、菌丝体、孢子粉中的三萜含量

如图1所示，灵芝子实体中三萜峰种类多，并含有酸性三萜和中性三萜；灵芝菌丝体中三萜含量较少，出峰时间基本在60 min后，主要是极性较低的中性三萜；而用分光光度法测定三萜含量很高的灵芝破壁孢子粉，在HPLC图谱中基本看不到峰。因此，分光光度法与HPLC法测定的结果完全不一致，特别是灵芝孢子粉中的三萜含量相差非常大。

图1　HPLC法测定灵芝各样品中总三萜含量Fig．1 Total triterpenoid content in Ganoderma lucidum by HPLC

2．3 灵芝酸A等对照品溶液最佳吸收波长的确定

为探讨两种方法为何有如此大的差别，分别将灵芝中所含的8种灵芝标准品与香草醛高氯酸反应，并进行紫外扫描，结果显示几种灵芝酸都可以与香草醛高氯酸产生颜色反应，其最佳吸收波长在530—550 nm（图2）。灵芝酸S的最佳吸收波长为550 nm，与齐墩果酸的最佳吸收波长相同；灵芝酸A、B、C2、DM、T的最佳吸收波长同为532 nm，灵芝酮三醇的最佳吸收波长为542 nm。同时试验还对灵芝中干扰物质油酸和麦角甾醇进行了测定，结果发现干扰物质麦角甾醇最佳吸收峰为542 nm，油酸的最佳吸收峰为522 nm和596 nm。因此，三萜测定所用波长为550 nm时，测定值与真实值会有一定的偏差。

图2　灵芝酸等对照品溶液最佳吸收波长Fig．2 The optimal absorption wavelengths of Ganoderma lucidum acids

2．4 灵芝酸A等8个标准品以及油酸和麦角甾醇与齐墩果酸对照品溶液显色比较和测定值比较

为了解不同的标准品与香草醛高氯酸反应后的偏差，取同样浓度的标准品及干扰物质各50 μg加入显色剂和高氯酸后，各样品液显色如图3所示，可以看出灵芝酸A、B、C2、DM、T样品液显较浅颜色，与齐墩果酸颜色相差大；灵芝酸S、灵芝酮三醇、灵芝醇样品液颜色较深，与齐墩果酸同浓度样品液比色相差很小；而干扰物质油酸颜色偏红，麦角甾醇样品液颜色也较深。

图3　灵芝酸等对照品溶液显色比较及测定值与实际值比较Fig．3 Color reaction and comparison of measured value and actual value of Ganoderma lucidum acids

550 nm下测定各样品液吸光度值，以齐墩果酸为标准品来计算50 μg灵芝酸标准品及干扰物的实测值，结果如图3所示，测定值与真实值所含三萜相差较大的为灵芝酸A、B、C2、DM、T；特别是灵芝中含量较高的灵芝酸A，测定值（1" 69 μg）只有真实含量（50 μg）的1/30，相差最大的灵芝酸DM的实际值（50 μg）是测定值（0" 97 μg）的51" 55倍。同时发现干扰物质的测定值较高，麦角甾醇的测定值已超过真实量的50％，而油酸的干扰也达到40％以上。

3 讨论

分光光度法与HPLC法分别测定灵芝子实体、孢子粉及菌丝体中三萜含量结果完全不一致，为探讨其原因，以齐墩果酸作为对照品，对不同的灵芝酸标准品进行测定值与真实值的比较，发现灵芝子实体中大量含有的灵芝酸A、B、C2等的含量被严重低估，而灵芝子实体和孢子油中所含的化学成分油酸和麦角甾醇则严重干扰测定结果。

灵芝子实体产量越来越大，用于保健产品中越来越多，如何控制灵芝及其提取物的质量，运用合适的测定方法十分重要。灵芝子实体中以酸性三萜为主，特别是灵芝酸A的含量较高，但如果用分光光度法进行测定，灵芝酸A的结果会严重偏低；而灵芝中也含有麦角甾醇，含量达到0" 24％［11］，甾醇及其类似物会干扰测定结果，使得测定值偏高。因此，运用分光光度法测定的结果不能如实反应灵芝中总三萜的含量，分光光度法不适合用于灵芝子实体及其提取物或产品的分析测定。

通过HPLC法发现灵芝孢子粉中基本没有三萜，但运用分光光度法可以测定出结果为2％左右，而孢子粉的升级产品孢子油同样用HPLC法测定不出三萜，而用分光光度法测定出结果高达10％，其主要原因是灵芝孢子粉中含有大量的油酸、亚油酸、麦角甾醇等干扰物质，香草醛高氯酸显色法没有特异性，不能区分干扰物质和三萜，运用分光光度法测定的结果基本都是干扰物质显色的结果。本试验表明，分光光度法不适合作为测定灵芝孢子粉及孢子油中三萜含量的方法。

参 考 文 献

［1］林志彬"灵芝的现代研究［M］"北京：北京医科大学出版社，2001：158"

［2］Carmen W H，Xin D" Chromatographic and dectrophorefie methods for Lingzhi pharmacologically active components［J］" J" Chromatogr" B，2004，812（1/2）：241-257"

［3］Lin C N，Tomp W P" Novel cytotoxic principles of Formosan Ganoderma lucidum［J］" J Nat Prod，1991，54（4）：998-1002"

［4］Min B S，Gao J J，Nakamura N，et al" Triterpenes from the Meth-A and LLC tumor cells［J］" Chem Pharm Bull，2000，48（7）：1026-1033"

［5］Li C H，Chen P Y，Chang U M，et al" Ganodericacid X，a lanostanoid triterpene inhibits topoisomerases and induces apoptosis of cancer cells ［J］" Life Sciences，2005，77：252-265"

［6］农业部食用菌产品质量监督检验测试中心"农业部备案标准NY/SJ 339—2001：灵芝三萜含量的测定［S］"北京：中国农业出版社，2001"

［7］王红梅，刘海燕，林淼，等，灵芝孢子粉中总三萜含量标准测定方法的改进［J］"食用菌学报，2013，20（2）：42-45"

［8］李保明，刘超，王洪庆，等"灵芝总三萜酸含量测定方法的研究［J］"中国中药杂志，2012，32（12）：1234-1236"

［9］农业部食用菌产品质量监督检验测试中心（上海）"农业部备案标准NY/T 2278—2012：灵芝产品中灵芝酸含量的测定高效液相色谱法［S］"北京：中国农业出版社，2013"

［10］胡居吾，范青生，肖小年"菌草灵芝孢子油与段木灵芝孢子油中脂肪酸组成的比较研究［J］"天然产物研究与开发，2006，18（4）：606-608"

［11］刘京晶，黄文华，吕明亮，等" HPLC法测定不同品种及段木栽培灵芝子实体中麦角甾醇含量［J］"中药材，2011，34（2）：187-190"

［12］张晓琦，庞国亮，程燕，等"赤芝孢子的三萜和甾体类成分研究［J］"中药材，2008，31（1）：41-44"

［13］张丽，王瑜杰，丁安伟" HPLC法测定灵芝孢子油中麦角甾醇的含量［J］"江苏中医药，2009，41（6）：42-43"

［14］章慧，张劲松，贾薇，等"超临界CO2萃取灵芝子实体三萜工艺优化及其与醇提法比较研究［J］"食用菌学报，2011，18（3）：74-78"

（责任编辑：闫其涛）

Discussion on the determination of total triterpenoids in Ganoderma lucidum by spectrophotometry

ZHANG Zhong1，ZHANG Jing-song1，2，3，LIU Yan-fang1，ZHOU Shuai1，WANG Jin-yan1，2，YU Hua-zheng1，3，TANG Qing-jiu1，2*
（1Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；National Engineering Research Center of Edible Fungi；Key Laboratory of Applied Mycological Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture，Shanghai 201403，China；2College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3School of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：Total triterpenoid content in fruit body，mycelium and spore powder of Ganoderma lucidum were determined by spectrophotometry and HPLC respectively，which showed that total triterpenoid content measured by different methods was quite different" The color reaction results of vanillin perchloric acid with different Ganoderma lucidum acid standard and oleic acid，ergosterol showed that the optimal absorption wavelengths of different Ganoderma lucidum acids are 530—550 nm" The measured value at 550 nm was quite different，especially the determination values of Ganoderma lucidum acid A，B and C with high content were seriously low，and the interfering substances of oleic acid and ergosterol had serious interference on the determination value" The results show that the determination value of total triterpene content in Ganoderma lucidum by spectrophotometry could not accurately reveal the actual total triterpene content of Ganoderma lucidum，which was not suitable for the determination of total triterpene content of Ganoderma lucidum"

Key words：Ganoderma lucidum；Triterpenoids；Spectrophotometry；HPLC

*通信作者：唐庆九（1969—），女，博士，研究员，主要从事食药用菌的研究与产品开发。E-mail：tangqingjiu＠saas" sh" cn

作者简介：张忠（1983—），男，硕士，助理研究员，主要从事食药用菌活性物质的研究与产品开发。E-mail：zhangzhong＠saas" sh" cn

基金项目：国家科技支撑计划子课题［食用菌功能因子提取制备及产品开发与产业化（2013BAD16B08-02）］；公益性行业（农业）专项子课题［食用菌副产物中活性物质提取及富集技术研究与示范（201303080）］

收稿日期：2014-11-05

文章编号：1000-3924（2016）01-061-05

中图分类号：S567" 3

文献标识码：A