布渣叶超高效液相指纹图谱研究

陈伟韬梁之桃周立敏周劲松赵中振

（1广东省中医药工程技术研究院，广东广州，510095；2香港浸会大学，香港；3广州中医药大学，广东广州，510405）



布渣叶超高效液相指纹图谱研究

陈伟韬1，2梁之桃2周立敏2周劲松3赵中振2

（1广东省中医药工程技术研究院，广东广州，510095；2香港浸会大学，香港；3广州中医药大学，广东广州，510405）

摘要目的：建立布渣叶超高效液相指纹图谱，为快速有效对布渣叶进行质量评价，改进其质量控制方法提供理论依据。方法：采用Waters Acquity BEH UPLC C18色谱柱（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm），以乙腈-0. 1%甲酸水溶液作为流动相梯度洗脱，检测波长为278 nm，流速为0. 3 mL／min，柱温为20℃；对建立的布渣叶指纹谱图进行相似度计算，并对数据进行主成分分析。结果：方法学考察结果良好，确立了11个共有峰，布渣叶指纹图谱的相似度明显高于伪品；主成分分析结果显示布渣叶密集分布在一个区域内，伪品分布在该区域外。结论：该方法稳定可靠，能对布渣叶药材作出真伪优劣评价，为建立布渣叶超高效液相指纹图谱提供理论依据。

关键词布渣叶；指纹图谱；超高效液相色谱。

Study on Chemlcal Flngerprlnt of Mlcroctls Follum by Ultra Performance Llquld Chromatography

Chen Weitao1，2，Liang Zhitao2，Zhou Limin2，Zhou Jinsong3，Zhao Zhongzhen2
（1 Guangdong Province Engineering Technology Research Institude of T. C. M.，Guangzhou China；2 Hong Kong Baptist University，Hong Kong China；3 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou China）

Abstract Objectlve：To establish the chemical fingerprint of Microctis Folium by ultra performance liquid chromatography（UPLC）. Methods：The separation was developed on ACQUITY UPLC BEH C18column（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm）by gradient elution with acetonitrile-water containing 0. 1%formic acid as mobile phase at a flow rate of 0. 3 mL／min，the detection wavelength at 278 nm and column temperature at 20℃. The fingerprint was evaluated by similarity assay and principal component analysis （PCA）. Results：Eleven characteristic peaks were established in the fingerprint，and two peaks were identified. The similarities of Microctis Folium was calculated and used for differentiating its adulterant. PCA showed that Microctis Folium and its adulterant were distinctly separated by the three most important principal components. Concluslon：The method is stable and reliable which could be applied to the authentication and quality control of Microctis folium.

Key Words Microctis Folium；Fingerprint；UPLC

布渣叶（Microctis Folium）来源于椴树科（Tiliaceae）植物破布叶（Microcos paniculata L.）的干燥叶。性凉、味微酸，归脾、胃经。有消食化滞，清热利湿的功效，可用于治疗饮食积滞，感冒发热，湿热黄疸［1-2］。布渣叶分布于广东、海南、广西、云南等地［3］。其中以广东分布资源最为丰富，广东的阳西、湛江是主产地。生于丛林中、灌丛中或路旁。本品无毒，民间有将其采叶晒干泡茶饮的习惯，亦是凉茶配方的常见材料，有清热、解渴、开胃的作用。

目前2010版中国药典对评价布渣叶质量的含量检测成分仅牡荆苷一项，牡荆苷具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、降糖等与布渣叶功效相关的药理作用［4-6］，但并无直接证据可表明牡荆苷为布渣叶的有效成分［7］，且以单一成分的检测来评价中药过于片面［8］，因此建立布渣叶指纹图谱具有科学意义。本研究采用UPLC建立布渣叶指纹图谱，与现时布渣叶指纹图谱的研究相比较，具有分析时间更短，分析能力更强的优点［9-10］。研究通过相似度计算、主成分分析等方法对指纹图谱进行评价，为布渣叶质量评价研究提供一种快速、高效的新方法。

1　资料与方法

1. 1 仪器 ACQUITY UPLC（Waters，配有二极管数组检测器，Empower2色谱工作站）；MILLIPORE纯水机（美国）；冷冻干燥机（TriadTM）；分析天平（AdventurerTM）；离心机（Eppendorf Centrifuge 5810）；高速离心机Eppendorf Centrifuge 5417R，超声仪（CREST）。

1. 2 试剂 甲醇为分析纯（RCI Labscan Limited）；液相色谱用的甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯（RCI Labscan Limited）；水为超纯水。

1. 3 药品 布渣叶药材经广州医药大学周劲松博士鉴定为椴树科植物破布叶（Microcos paniculata L.）的干燥叶，样品来源见表1，其中18至21号为新鲜采摘后冷冻干燥品，10号样本为伪品。牡荆苷（上海同田生物技术有限公司，13082932）；异牡荆苷（成都瑞芬思生物科技，Y-116-131015）；布渣叶对照药材（中国药品生物制品检定所，QUZL-8E3N）。

表1　布渣叶药材样品来源表

1. 4 方法

1. 4. 1 色谱条件 色谱仪：ACQUITY UPLC（Waters）；色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm）；流动相：流动相A为0. 1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，按表2进行梯度洗脱；柱温：20℃；流速：0. 3 mL／min；检测波长：278 nm；进样量：2 L。

表2　梯度洗脱条件

1. 4. 2 对照品溶液的制备 精密称取牡荆苷、异牡荆苷适量，加入100%甲醇溶解，配成每1 mL含0. 1 g的混合对照品溶液，即得。

1. 4. 3 供试品溶液的制备 取各批次布渣叶样品粉末（过40目筛）约1 g，置于50 mL离心管中，精密加入100%甲醇20 mL，称定重量，超声（220 W，40 kHz）60 min，冷却，用100%甲醇补足减少的重量，以3 000 r／min离心5 min，取上清液1 mL至2 mL离心管中，再以12 000 r／min离心10 min，取上清液，即得。

图1　22批药材样品UPLC色谱图

图2　对照品UPLC色谱图

图3　典型布渣叶UPLC指纹图谱

2　结果

2. 1 精密度试验 取同一份布渣叶样品供试品溶液（3号样品），连续进样3次。记录主要色谱峰保留时间和峰面积，各色谱峰保贸时间RSD为0. 02% ～0. 19%；各色谱峰峰面积RSD为3. 08%～8. 04%。结果表明仪器精密度良好。

2. 2 稳定性试验 取同一份布渣叶供试品溶液（3号样品）分别在0、2、4、8、12、24、48 h进样分析。记录主要色谱峰保留时间和峰面积，各色谱峰保贸时间RSD为0. 09%～0. 42%；各色谱峰峰面积RSD 为3. 33%～8. 58%。结果表明各成分在48 h内性质稳定。

2. 3 重复性试验 取同一批次的布渣叶样品粉末3份（3号样品），分别按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样分析。记录主要色谱峰保留时间和峰面积，各色谱峰保留时间RSD为0. 04%～3. 23%；各色谱峰峰面积RSD为0. 44%～7. 43%。结果表明试验重复性良好。

2. 4 布渣叶指纹图谱分析

2. 4. 1 布渣叶指纹图谱建立 取布渣叶药材21批以及对照药材，共22批，按1. 4. 3项下制备供试品溶液，以1. 4. 1项色谱条件检测，得22批样品（含对照药材和伪品）色谱图，见图1。取对照品溶液，以相同条件检测，见图2。从图1可明显看出10号样品为伪品，18～21号样品为新鲜采摘后冷冻干燥品，图谱与其他布渣叶样品的比较有差异。从其余17批样品中可见典型布渣叶UPLC指纹图谱，存在11个共有峰，根据对照品色谱图，指认出其中2个共有峰，分别为牡荆苷、异牡荆苷，见图3。

2. 4. 2 共有峰相对保留时间和相对峰面积计算

以6号共有峰为参照，分别计算各批布渣叶样品和对照药材图谱中11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3、表4。结果显示11个共有峰的相对保留时间RSD小于1%，共有峰的平均相对保留时间（min）为：0. 36、0. 46、0. 61、0. 63、0. 78、1. 00（牡荆苷）、1. 03（异牡荆苷）、1. 24、1. 45、1. 54、 1. 61。11个共有峰的相对峰面积变异较大，显示不同来源的布渣叶样品之间，其质量差异较大。

表3　11个共有峰的相对保留时间

表4　11个共有峰的相对峰面积

表5　布渣叶色谱图与对照药材色谱图相似度计算

2. 4. 3 相似度分析 把21批布渣叶样品色谱图导入中药色谱图分析和数据管理系统软件，以对照药材为参照图谱，用全图谱夹角余弦法计算各样品与之的相似度，见表5。结果显示10号样品的相似度明显低于其他样品，支持10号样品为伪品的结论。

2. 4. 4 主成分分析 把22批（含对照药材）布渣叶指纹图谱导入IBM SPSS 21 Statistics软件对数据进行主成分分析，见图4。由于10号样品外观性状上与正品布渣叶也存在明显不同，可明确其为伪品。主成分分析结果显示10号样品的指纹图谱特征明显与其他样品不同，本研究所建立的化学指纹图谱明显可以区分布渣叶伪品。同时，相似度分析结果与主成分分析结果一致，2种方法得到了相互验证。见图4。

图4　22批（含对照药材）布渣叶主成分分析结果

3　讨论

实验对色谱条件和样品制备方法进行了考察。色谱检测采用DAD检测器作全波长扫描，其中278 nm，色谱峰较多，峰面积较大，峰形较好，色谱信息丰富，故选择278 nm作为检测波长。

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液3种流动相系统，发现乙腈-甲酸水溶液系统色谱峰信息最为丰富，并最终选择乙腈-0. 1%甲酸水溶液作为流动相。另甲醇-水系统会导致柱压较高，缩短色谱柱使用寿命，不建议使用。

实验还考察了柱温分别为20℃、30℃、40℃时对色谱图的影响，发现随着柱温升高，保留时间减少，部分色谱峰峰面积减少甚至消失，综合考虑，选择20℃作为柱温。

在样品制备方面，比较了用不同浓度甲醇提取样品和不同提取方法对色谱图的影响。当中以100%甲醇提取样品所得的色谱图色谱峰最多，峰面积最大，选定为提取溶剂。又考察了超声与加热回流两种提取方法，发现无明显差异，由于超声方法操作较为简便，故选作为样品提取方法，超声时间为60 min。

本研究采用超高效液相色谱法对21批布渣叶样品进行分析，建立布渣叶指纹图谱，通过相似度计算和主成分分析对指纹图谱进行评价，结果表明实验方法通过方法学考察，结果良好，成功建立了布渣叶超高效液相指纹图谱，确立了11个共有峰。图谱评价，结果发现10号样品相似度明显较其他样品低，主成分分析亦表明10号样品与其他样存在较大差异，两种评价方法结果一致。因此该方法能从布渣叶样品中把伪品区分开来，达到鉴别和质量控制的目的。

观察图1可得不同布渣叶样品之间色谱峰差异主要体现在25～40 min这段时间内，表明出该部份化学成分及其含量的不同，在比较药材粉末后发现，不同样品粉末颜色有所不同，从褐至墨绿不等，这提示成分差异可能与植物色素或其他物质有关。

另外，四批新鲜采摘后经冷冻干燥的18～21号样品相似度相对较低，原因可能与采收时间和干燥方法有关。

中药指纹图谱与以往的单一成分检测相比较，更能体现中药的复杂性和整体性，更好地中药质量进行评价。现时中药色谱指纹图谱中以高效液相色谱法的研究较多，已有关于布渣叶高效液相指纹图谱的文献报道［11］。本次研究运用的超高效液相色谱法较以往的高效液相色谱法具有分析时间短，分离度、灵敏度高的优点，研究应用前景广阔［12］。本研究建立的布渣叶超高效液相指纹图谱经过方法学验证，有良好的稳定性和重现性，为布渣叶质量控制的进一步研究提供理论依据。

参考文献

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（2015－05－25收稿 责任编辑：张文婷）

思路与方法

中图分类号：R285. 5

文献标识码：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 040

通信作者：赵中振，男，博士，教授，研究方向：中药鉴定和中药品质控制方面的研究，Tel：（00852）34112424；E-mail：zzzhao＠hkbu. edu. hk

作者简介：陈伟韬（1990—），男，硕士，研究方向：中药质量分析的研究；E-mail：chenwt009＠126. com

基金项目：广东省中医药局建设中医药强省项目（编号：20142012）