孔雀石绿在鳜鱼幼鱼体内的富集和消除规律

黄向荣，李小玲，黄华伟，万译文，曾春芳，陈湘艺，肖　维，李传武（1.湖南省水产科学研究所，湖南　长沙　410153；.农业部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙），湖南　长沙　410153；3.湖南省水产原种场，湖南　长沙　410153；4.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南　常德　415000）



孔雀石绿在鳜鱼幼鱼体内的富集和消除规律

黄向荣1,2,4，李小玲1,2，黄华伟1,2，万译文2，曾春芳2，陈湘艺2，肖维2，李传武1,3,4
（1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙410153；2.农业部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙），湖南长沙410153；3.湖南省水产原种场，湖南长沙410153；4.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德415000）

摘要：用0.5、1.0和2.0 mg/L的孔雀石绿（MG）药浴人工繁养的鳜鱼（Siniperca chuatsi）幼鱼 [（1.30± 0.05）g、（4.6±0.2）cm ] 2 h后，再转移至水泥池中微流水饲养，用HLPC-MS法跟踪监测鳜鱼幼鱼体内孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿的残留量。结果表明：药浴至80～100 min时，孔雀石绿总量在鳜鱼幼鱼体内的富集达到峰值；停止药浴后15 min时，孔雀石绿总量明显下降；停药后6～16 d时孔雀石绿已基本代谢为隐色孔雀石绿；孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在鳜鱼幼鱼体内的残留量分别于停药后37、55 d时低于判定值1.0 µg/kg；在鳜鱼幼鱼体内，隐色孔雀石绿的消除速度明显低于孔雀石绿。

关键词：鳜鱼；孔雀石绿；隐色孔雀石绿；残留；消除规律

孔雀石绿（Malachite green，MG）又名碱性绿，为有毒的三苯甲烷类化学物[1-2]，曾被用作化工染料，以及水产动物水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等的杀菌剂[3]。MG及其代谢产物隐色孔雀石绿（Leucomalachite green，LMG）残留时间长，具有致癌、致畸和致突变等毒性[4]，欧美等国家和地区将其列入水产养殖禁用药物，我国也于2002年5月将其列入“食品动物禁用的兽药及其化合物清单”。但因孔雀石绿高效价廉，替代品少，仍有少数养殖和经营者在苗种、商品鱼的养殖、运输和销售等环节中违规使用或误用，严重影响水产品的质量安全。因此，研究水产苗种中孔雀石绿残留监测及消除规律尤为重要。

鳜鱼（Siniperca chuatsi）是我国的特色优质经济鱼类品种。近年来常有鳜鱼体内检测出孔雀石绿的报道。目前，已有孔雀石绿在鲫鱼（Carassius auratus）[5]、欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）[6]、大菱鲆（Psetta maxima)）[7]、罗非鱼（Oreochromisco）[8]、青石斑鱼（Epinephelus awoara）[9]、斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）[10]以及杂交鳢（Channa maculata♀×Channa argus♂）[11]等鱼类体内代谢消除的研究，而有关鳜鱼体内孔雀石绿消除规律研究却鲜有报道。笔者以鳜鱼幼鱼为对象，用不同浓度的孔雀石绿对鳜鱼进行药浴，然后转入微流水饲养，研究药浴期间孔雀石绿在鳜鱼体内的富集以及停药后孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在鳜鱼幼鱼体内的消除规律，以期为职能部门加强药物监管以及食品安全溯源提供理论和技术支持。

1　材料与方法

1.1试验用鱼

鳜鱼幼鱼2100尾，由湖南省澧县柳耳坝鱼类苗种繁育场提供，为人工繁殖的翘嘴鳜鱼苗种，体质健壮，无残缺及伤病，初始体质量为（1.3± 0.05）g，体长为（4.6±0.2）cm，无MG及LMG残留。幼鱼暂养2 d，暂养期间不投饵。

1.2试剂与仪器

孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）标准品及其同位素内标氘代孔雀石绿（D5-MG）、氘代隐色孔雀石绿（D6-LMG），纯度大于98%，均购自德国Dr.Ehrensorfer公司；乙腈和甲醇，色谱纯，德国MERCK公司；中性氧化铝柱，500 mg/3mL，美国 Supelclean；乙酸铵为分析纯，实验用水由Millipore纯水系统所制。

试验仪器有Thermo TSQuatum液相色谱-串联质谱联用仪、配有电喷雾（ESI）离子源、超纯水仪、高速冷冻离心机（日本日立公司）、超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）、平行蒸发仪（瑞士Buchi）、FA25均质器（德国Fluko公司）、精密电子天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）、漩涡振荡器、固相萃取装置（美国Supelco公司）等。

1.3养殖条件

试验于湖南省水产原种场繁育基地进行，试验池4个，面积200 m2。所有养殖池排灌方便，试验前一周用生石灰消毒，经测试安全后投入使用。试验用水体无MG及LMG残留。采用微流水养殖，日换水量约为40%，保持水质清新，水温22.0～31.5℃，溶氧不低于5 mg/L，pH值为6.42～6.86，透明度为40～50 cm。

1.4试验设计

1.4.1试验分组及给药试验设3个试验组及1个空白对照组，每组鳜鱼各500尾。试验组分别用0.5、1.0、2.0 mg/L的孔雀石绿溶液药浴120 min；对照组鳜鱼不使用孔雀石绿药浴。

1.4.2样品采样与制备药浴期间分别在药浴后20、40、60、80、100、120 min采样。待药浴2 h后，立即捞出幼鱼，分别转入对应的水泥池中微流水养殖。分别于停药后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、12 d、16 d、20 d、25 d、30 d、35 d、40 d、45 d、50 d、55 d、60 d、65 d、70 d、75 d、80 d采样。每个时间点各组随机采集 2个平行样，每平行样幼鱼5～8尾，置于-20℃速冻保存。制样时，先将每份样品自然解冻，待去除鳜鱼头部及鳍条后，再将剩余组织匀浆混匀，于-20℃条件下保存备用。每组检测结果取平行样品测定值的平均值。

1.5样品前处理

参照GB/T 19857-2005[12]进行。称取匀浆后鳜鱼样品（5.00±0.05）g于50 mL离心管中，加入1.00 mL混合内标标准溶液，加入11 mL乙腈，经超声波振荡提取5 min，均质提取30 s，以8 000 r/min离心10 min，上清液转移至25 mL比色管中；用11 mL乙腈重复提取1次，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，摇匀备用。移取5.00 mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上（使用前用5 mL乙腈活化），用10 mL玻璃离心管接收流出液，用4 mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45 ℃条件下旋转蒸发至近干，残液中准确加入2.00 mL体积比1∶1乙腈-乙酸铵（5 mmol/L），超声振荡1 min，样液经0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.6色谱条件

色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(2.1 mm×100 mm，5 μm)；柱温：35 ℃，流动相A为乙腈；B为5 mmoL/L的乙酸铵溶液（含体积分数0.1%的甲酸）；进样体积：10 μL；流速：0.35 mL/min，流动相梯度洗脱条件如表1所示。质谱条件如表2所示。

表1　流动相梯度洗脱条件Tab.1 The gradient elution conditions of mobile phase

表2　质谱参数条件Table 2　MS parameter conditions

2　结果与分析

2.1孔雀石绿及隐色孔雀石绿标准色谱图

在上述色谱条件下，MG和 LMG标准溶液基线平稳，峰形良好，无干扰峰，其保留时间（Retention time,RT）分别为5.71、7.85 min，分别如图1、2所示。

图1　孔雀石绿标准溶液提取离子流色谱图（25 ng/mL）Fig.1　Extraction ion chromatograms of malachite green standard solution（25 ng/mL）

图2 隐色孔雀石绿标准溶液提取离子流色谱图（25 ng/mL）Fig.2　Extraction ion chromatograms of leucomalachite green standard solution（25 ng/mL）

2.2标准曲线与线性范围

在质量浓度为1～25 ng/mL范围内，以峰面积（Y）与质量浓度（X）绘制标准曲线，MG和LMG的标准方程分别为Y=33.14 X + 2.01和Y=23.54 X + 63.88，相关系数r分别为0.999 4和0.999 6。

2.3回收率与精密度

在加标水平2～10 µg/kg时，MG和LMG的回收率及相对标准偏差见表3。

表3　空白样品加标回收率和精密度Table 3　Recoveries of spiked samples and RSD

2.4药浴期间鳜鱼幼鱼体内孔雀石绿和隐色孔雀石绿富集变化

对供试鳜鱼幼鱼用孔雀石绿药浴2 h期间，在药浴20 min后，MG在鳜鱼幼鱼体内富集，并迅速转化为LMG，0.5、1.0、2.0 mg/L组鳜鱼幼鱼体内的MG质量分数分别达20.9、34.7、55.4 µg/kg；同时，LMG质量分数则分别达116.4、338.9、405.2 µg/kg。随药浴时间的延长，MG和LMG的残留量呈逐渐升高趋势，具体表现为：0.5 mg/L组在药浴100 min时，MG残留量达峰值为78.8 µg/kg，LMG在120 min时，其残留量达峰值为722.7 µg/kg；1.0 mg/L组在药浴80 min时，MG残留达峰值81.1 μg/kg，LMG 在100 min时残留达峰值1 196.7 μg/kg；2.0 mg/L组在药浴80 min时，MG残留量达峰值97.9 µg/kg，LMG在药浴100 min时达峰值为1 456.9 µg/kg（表4）。

表4 药浴期间MG和LMG在鳜鱼幼鱼体内的富集浓度Table 4　Enrichment concentration of MG and LMG in Siniperca chuatsi Parr during exposure process with malachite green µg/kg

2.5停药后鳜鱼幼鱼体内孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量变化

停止药浴后，将供试鳜鱼幼鱼转入水泥池微流水养殖。总体而言，鳜鱼幼鱼转入清水后，其体内MG和LMG的代谢呈前期消除速率慢，中期加快，后期逐渐变缓的态势（表5）。不同组间，药浴浓度越高，MG和LMG在鳜鱼幼鱼体内的残留量越高，代谢时间越长，但鳜鱼幼鱼体内MG的代谢速度均明显快于LMG，表现为0.5、1.0、2.0 mg/mL组幼鱼体内MG分别于停药后6、12、16 d时已检测不出，而LMG分别至37、45、55 d时而低于方法检出限。

表5　停药后MG和LMG在鳜鱼幼鱼体内的残留量Table 5　Residual quantity of MG and LMG in Siniperca chuatsi parr after the medicated bath treatment with malachite green　　　　　　　　　　　µg/kg

续表　5(Con tinued)

3　讨 论

3.1药浴期间鳜鱼幼鱼体内孔雀石绿和隐色孔雀石绿富集变化

研究表明，孔雀石绿及其代谢物对水产动物的毒性不仅与水产动物种类和规格、暴露时间、用药浓度以及水温相关，而且与水质环境，尤其是pH值、硬度和溶解氧有关[13]。同时，MG进入动物体内后，通过生物转化，转化成脂溶性主要代谢产物LMG并在组织中蓄积[14]，其残留毒性比MG更强。本试验条件下，供试鳜鱼幼鱼用孔雀石绿药浴2 h期间，在药浴20 min后，MG在鳜鱼幼鱼体内富集，并迅速转化为LMG，而且药浴浓度越高，MG和LMG在鳜鱼体内的富集也相应越高，其残留量达到峰值所需时间也相对较短，这与高露姣等[6]对欧洲鳗鲡以及杨贤庆等[8]对罗非鱼的研究结果较为一致。

此外，彭景书等[9]分别研究了不同药浴浓度及药浴时间两种作用方式下MG在青石斑鱼体内的富集和消除规律，结果显示，用0.10、0.15、0.20 mg/L的孔雀石绿浸泡青石斑鱼5 h，随着药浴浓度的增加，MG的残留水平也增高；同时，药浴浓度相同条件下，连续药浴5 h组较3次间断药浴15 min组青石斑鱼体内的MG含量高，这与本研究的随着用药浓度的增加及药浴时间的延长，MG和LMG的残留量也逐渐升高的结果较为相似。上述研究也进一步表明，MG和LMG在水产动物体内的富集量与用药浓度和用药时间成正相关。

3.2停药后鳜鱼幼鱼体内孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量变化

跟踪检测药浴期间和停药后供试鳜鱼幼鱼体内的MG和LMG含量，结果表明，在药浴80～100 min内，各试验组鳜鱼体内的MG均已达到峰值，药浴100～120 min内各组LMG的残留量达到峰值；同时，鳜鱼幼鱼转入清水后，其体内MG和LMG的残留量均会出现一个明显的回落，并且总体呈现出前期代谢消除速率慢，中期加快，后期减缓的态势，这与彭景书等[9]的青石斑鱼肌肉组织中MG的消除规律较为一致。

诸多研究表明，MG在水产动物体内的代谢速率明显快于LMG。在养殖鱼类方面，邱绪建等[5]研究表明，鲫鱼在0.2 mg/L孔雀石绿药浴1 h转入清水后20 d 肌肉中检测不出MG，而LMG则在30 d后仍有17.7 µg/kg的残留；曲志娜等[7]以800 ng/mL 的MG溶液药浴大菱鲆1 h，结果发现，MG消除至检出限以下需20.3 d，LMG则需281.9～356.7 d；杨贤庆等[8]研究指出，用0.5、2.0 mg/L 的MG药浴罗非鱼1 h，60 d后各试验组均检测不出MG，但LMG仍有检出。此外，杨金兰等[15]以0.15 mg/L的MG溶液药浴凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）幼虾2 h，结果发现，MG代谢消除完毕需3 d，而LMG则需9 d。另外，黄金田等[16]用2 mg/L MG溶液药浴中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）1 h后发现，药浴后34 d MG 及LMG在中华绒螯蟹体内的残留量均低于检测限，MG的代谢速率快于LMG。本文研究表明，各试验组分别于停药后6、12、16 d时MG残留量低于检测限，而LM分别至37、45、55 d时方未检出，这与上述研究结果基本一致，代谢时间不同可能与供试对象种类、规格、用药时间与方式、水体环境以及饲养管理等因素有关。

本研究方案设计、鳜鱼幼鱼养殖日常管理得到了中国水产科学研究院王群博士、湖南省水产科学研究所伍远安研究员、湖南省水产原种场曾国清副研究员、李绍明副研究员和澧县柳耳坝鱼类苗种繁育场麻和才等同志的大力帮助，谨致谢忱。

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（责任编辑：刘庆颖）

Accumulation and Elimination of Metabolic Regularity of Malachite Green in Siniperca chuatsi Parr

HUANG Xiang-rong1,2,4,LI Xiao-ling1,2,HUANG Hua-wei1,2,WAN Yi-wen2,ZENG Chun-fang2,CHEN Xiang-yi2,XIAO-wei2,LI Chuan-wu1,3,4
（1.Fishery Science Research Institute of Hunan Province,Changsha 410153,China; 2.Fishery Products Quality Supervision and Inspection with Test Center of the Ministry of Agriculture in Changsha,Changsha 410153,China; 3.The Aquatic Seed Farm of Hunan Province,Changsha 410153,China; 4.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province,Changde 415000,China）

Abstract:The artificial breeding Siniperca chuatsi Parr,with body weight(1.30±0.05)g,body length(4.6±0.2)cm,were bathed for two hours malachite green solution with concentrations of 0.5,1.0 and 2.0mg/L,and then transferred to the cement ponds that feeding by micro flowing water.During artificial cultivation period,high performance liquid hromatography-mass spectroscopy(HLPC-MS)was employed to monitor the residue of malachite green and its metabolite leucomalachite green in Siniperca chuatsi Parr that by periodic sampling.The results showed that the total amount of malachite green accumulated in S.chuatsi reached the peak value when medicated bath for 80–100 min.Besides,the total amount of malachite green decreasedbook=52,ebook=55significantly when the time reached 15 minutes after the medicated bath by micro flow feeding.In addition,the malachite green in S.chuatsi were basically metabolized into leucomalachite green when the time reached six to sixteen days after the medicated bath.Moreover,the residual quantity of malachite green and its metabolite leucomalachite green in S.chuatsi were lower than the decision value(1.0 μg/kg)when the time reached thirty-seven and fifty-five days,respectively,after the medicated bath.At the same time,the metabolic rate of leucomalachite green in Siniperca chuatsi Parr was obviously slower than that of malachite green.

Key words:Siniperca chuatsi; malachite green; leucomalachite green; residual; eliminate metabolic regularity

通信作者：李小玲（1976－），女，高级农艺师，主要从事水产品质量安全及渔业生态环境监测方面的研究，E-mail:hns-11@126.com

基金项目：国家水产品质量安全监测基金项目(2011C008)；湖南省养殖业科研指导项目(201115)；长沙市基础性研究与软科学资金专项重点项目（K1308009-31）

收稿日期：2015-06-30

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.009

中图分类号：S942.2+.2

文献标志码：A

文章编号：1673-9159（2016）01-0051-06

第一作者：黄向荣（1964－），男，副研究员，主要从事水产品质量安全及渔业生态环境方面的研究。