哈维氏弧菌qnr基因的克隆及原核表达条件优化

周　维，汤菊芬，高增鸿，甘　桢，简纪常，吴灶和，丁　燏

（1.广东海洋大学水产学院，广东　湛江　524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东　湛江　524088；3.仲恺农业工程学院，广东　广州　510225）



哈维氏弧菌qnr基因的克隆及原核表达条件优化

周维1,2，汤菊芬1,2，高增鸿1，甘桢1,2，简纪常1,2，吴灶和2,3，丁燏1,2

（1.广东海洋大学水产学院，广东湛江524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江524088；3.仲恺农业工程学院，广东广州510225）

摘要：根据GenBank中公布的哈维氏弧菌qnr基因序列设计引物扩增哈维氏弧菌qnr 序列，将其插入pET-32a质粒，构建原核表达载体pET32-qnr，并对诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化。结果表明，哈维氏弧菌qnr全长651 bp，编码216个氨基酸；重组蛋白优化条件为于28 ℃、IPTG浓度为0.05 mmol/L条件下诱导6 h。关键词：哈维氏弧菌；qnr基因；原核表达；优化

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）隶属于弧菌科（Vibrionaeeae），弧菌属（Vibrio），是一种嗜盐性革兰阴性菌，弯杆状，极生单鞭毛[1-2]，主要分布于海洋环境和海洋生物体中，是多种海洋鱼类和无脊椎动物的条件致病菌[3-4]，在对虾幼体阶段危害尤为严重，曾导致斑节对虾、凡纳滨对虾幼体大量死亡[5-7]，给水产养殖业带来巨大损失。目前，国内弧菌病的防治主要依赖于抗生素和化学药物，喹诺酮类药物在水产养殖业中应用广泛，水产养殖环境中的细菌对此类药物的耐药性日趋显著[8-10]，且部分耐药菌可将其耐药基因或耐药质粒转移给其他菌株，甚至通过食物链传递而威胁人类健康[11-12]。1998年，在细菌质粒上发现可水平传播的喹诺酮类耐药基因qnr[13]，其编码的蛋白可保护喹诺酮类药物的作用靶酶（DNA促旋酶和拓扑异构酶IV），从而降低细菌对此类药物敏感性。随后在多种细菌的染色体和质粒上发现了一系列qnr基因家族[14-21]，并有很多证据支持水生来源的微生物是质粒上qnr的最初来源，其中包括弧菌[15-16,20]。qnr基因的广泛分布和多变异性暗示有更多qnr基因尚待发现。

随着基因测序技术的进步和推广，许多细菌的基因组已经完成测序，目前，在水生细菌哈维氏弧菌的全基因组中也发现了qnr相似基因，但尚无其功能和作用的研究报道，本实验首次从哈维氏弧菌基因组中扩增出qnr基因，并构建重组表达菌株，对融合蛋白表达进行了优化，为进一步研究哈维氏弧菌染色体上qnr基因编码蛋白的特性和功能，以及细菌对喹诺酮类药物的耐药机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和载体哈维氏弧菌ZJ0603分离自广东省湛江海域患病红笛鲷（Lutjanus sanguineus），分离鉴定后由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室保存。克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司，表达载体pET-32a、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α以及表达菌株BL21(DE3)均由该实验室保存。

1.1.2主要试剂ExTaq DNA聚合酶，r Taq DNA聚合酶，限制性核酸内切酶BamH I、 Xho I，T4连接酶购自TaKaRa公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司。氨苄西林（Amp+）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自上海生工有限公司。考马斯亮蓝快速染色液购自天根生化科技（北京）有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1哈维氏弧菌菌株的活化及基因组DNA的提取将-

80 ℃保存的哈维氏弧菌ZJ0603接种于TSA平板上，于28 ℃恒温生化培养箱中倒置培养18 h后挑取单菌落接种于含20 mg/mL NaCl 的TSB液体培养基，于28 ℃条件下振荡培养12～16h，收集菌液2～5 mL于离心管中，并参照试剂盒说明书提取细菌DNA。

1.2.2qnr基因的扩增根据GenBank上哈维氏弧菌全基因组（登录号CP009468.1）预测的喹诺酮类耐药基因qnr序列，通过primer 5.0设计上游引物QF：5'-CGCGGATCCA TGATTAAGACCGATCTC A-3'；下游引物QR:5'-CCGCTCGAGCTAAATAAC GATCAGGCCAA-3'，下划线部分分别为BamH I和Xho I酶切位点及其保护碱基。以1.2.1中提取的DNA为模板，用设计的引物扩增目的基因片段（PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃40 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72℃ 10 min）。将纯化后PCR产物与pMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态，在含100 µg/mL Amp+的LB平板上培养10～14 h，挑取单菌落进行PCR鉴定，并将阳性克隆送至上海生物工程有限公司测序，并用BLAST分析比对序列。

1.2.3表达载体的构建提取测序正确的重组质粒pMD18-qnr和表达质粒pET-32a，用BamH I、Xho I于37 ℃恒温水浴锅中酶切2 h，回收目的条带和载体，并用T4连接酶连接10 h后转化至大肠杆菌DH5α。通过含氨苄的LB抗性平板筛选并结合菌落PCR，挑选阳性克隆送测。提取阳性克隆重组质粒pET32-qnr转化至BL21(DE3)，同样挑选阳性克隆送测。

1.2.4融合蛋白的诱导表达将测序正确的含重组质粒的表达菌株接种于终浓度为100 µg/mL Amp+的LB液体培养基，当D(600 nm)为0.4～0.6时，加IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37 ℃条件下诱导5 h后收集细菌，提取蛋白进行SDS-PAGE，同时以未诱导的含重组质粒pET32-qnr的表达菌株及含空质粒pET-32a的BL21(DE3)表达菌株诱导前后作对照。

1.2.5原核表达条件优化将构建成功的重组表达菌株从温度、时间、IPTG浓度3个方面进行表达条件优化。

1）温度。在28、37 ℃条件下（IPTG终浓度为0.5 mmol/L）诱导5 h，分别收集10 mL菌液后置于冰上进行超声破碎，程序为：功率200 W，超声5 s，间隔5 s，超声破碎约15 min至菌液澄清。取离心后的菌体裂解液的上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析。

2）时间。其他条件不变，在诱导后的1、2、3、4、5、6、7 h分别收集菌体，进行SDS-PAGE分析。

3）IPTG浓度。其他条件不变，在 IPTG浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mmol/L下诱导，分别处理菌体，进行SDS-PAGE分析。

2　结果与分析

2.1目的基因 PCR扩增结果

根据设计的引物扩增到一长约600 bp的条带，而未加DNA模板的阴性对照未扩增出相应条带（图1），菌落PCR的扩增结果与目的条带大小相符（图1）。经测序，扩增的基因开放阅读框（ORF）为651 bp，编码216个氨基酸，BLAST比对结果表明，与哈维氏弧菌ATCC33843的Qnr编码氨基酸序列同源性为99%，与霍乱弧菌（Vibrio cholerae）染色体上QnrB1（EKM30619.1）的同源性为96%，与副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）Qnr（WP_005482928.1）同源性为78%，具有Qnr蛋白特有的五肽重复序列。将该序列提交至GenBank，登录号为KT633378。根据推导的Qnr氨基酸序列，预测其分子质量为24.5 ku，理论等电点为4.75。

图1　qnr基因PCR扩增和菌落PCR鉴定Fig.1　Cloning and colony identification by PCR of qnr gene

2.2原核表达载体的构建

提取阳性菌落的重组质粒pMD18-qnr，双酶切鉴定结果如图2。图2可见，BamH I和Xho I双酶切pMD18-qnr后获得两条带，其中目的条带与直接扩增的qnr条带大小一致，经测序比对证实为qnr目标基因序列，表明qnr的克隆载体构建成功。回收目的片段与双酶切后pET-32a 连接、转化后，同样挑选阳性菌落进行双酶切鉴定，得到两个片段（图2），测序未发现有突变及错配现象，说明pET32-qnr表达载体构建成功。

2.3融合蛋白的诱导表达

将测序正确的pET32-qnr重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞后，在37℃条件下经0.5 mmol/L IPTG诱导5 h，得到分子质量约为42.5 ku的融合蛋白（图3），其中预测的Qnr分子质量为24.5 ku，pET32a表达的标签蛋白约为18 ku（图3）。未诱导的菌及诱导的含空质粒的菌均没有出现目的条带，说明融合蛋白成功表达。

图2　qnr基因克隆载体及原核表达载体的鉴定Fig.2　Identification of cloning and prokaryotic expression vector of qnr

图3　融合蛋白的原核表达Fig.3　Prokaryotic expression of pET32-qnr recombinant protein

2.4原核表达条件优化

图4表明，在37℃诱导条件下，目的蛋白主要存在于菌体裂解液的沉淀中，在菌体裂解液上清中含量极低，在28℃诱导条件下，目的蛋白在菌体裂解液沉淀和上清中均有表达，且表达量高于37℃下的表达量。这说明目的蛋白Qnr的最佳诱导温度是28℃，主要以包涵体形式存在。时间优化结果（图4）表明，随着诱导时间的增加蛋白表达量随之增加，诱导6 h时表达量最高，之后蛋白表达量开始下降，因此，目的蛋白Qnr的最佳诱导时间是6 h。图4可见，用0.05～1.00 mmol/L IPTG诱导的目的蛋白表达量均较高。由于 IPTG具有细胞毒性，高浓度IPTG反而会妨碍细菌生长，因此最佳诱导浓度定为0.05 mmol/L。

图4　融合蛋白诱导条件的优化Fig.4 The optimization inducing conditions of the pET32-qnr fusion protein

3　讨 论

养殖水体细菌及噬菌体种类、数量繁多，成为耐药基因孕育和传播的主要温床。一些由细菌染色体介导的耐药基因可通过转导和基因重组等方式进行水平传播，造成了海洋细菌耐药机制的多样性和传播途径的复杂性，抗生素的滥用促使细菌耐药性的传播和扩散速度更加广泛和迅速[22]。因此，研究耐药基因的来源和特征对于耐药菌的预防和控制很有必要。对于临床耐药菌中质粒上qnr基因的起源和进化研究表明，质粒上的qnr基因很可能源自水产细菌的染色体，且通过水平传播而来[14]。有学者[15]克隆了海洋中创伤弧菌Vibrio vulnificus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus等参考菌株染色体上的qnr相似基因，分析其与肠杆菌中质粒上QnrA、QnrB 和QnrS蛋白的同源性为40%～67%，并在大肠杆菌里表达，结果含有重组质粒的大肠杆菌对喹诺酮类药物的敏感性均有所降低，表明水环境中的弧菌科很可能是喹诺酮耐药蛋白Qnr的储藏库，弧菌科中已知的qnr相似序列有助于发现其他细菌中质粒介导的新型qnr基因。之后用同样的方法又发现灿烂弧菌（V.splendidus）是质粒上QnrS家族的来源[16]。Sanchez等[17]在宏基因组里找到了多种水产细菌染色体的潜在qnr基因，并证实了嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）染色体上Smqnr编码的蛋白为喹诺酮耐药蛋白。本研究在海洋中常见的条件致病菌哈维氏弧菌的基因组里也发现了潜在的qnr基因，并通过序列分析发现其同源性与霍乱弧菌QnrB1（EKM30619.1）和副溶血弧菌Qnr(WP_005482928.1)同源性很高，分别为98%和78%，且具有五肽重复序列，与已证实的Qnr蛋白的结构特征相符，说明哈维氏弧菌同其他弧菌一样，其染色体上的qnr基因是一种潜在的可水平传播的耐药基因。

随着越来越多qnr基因的发现，对Qnr蛋白结构的研究也进一步深入。已克隆、表达、纯化嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的AhQnr，并获得晶体结构，找出其与DNA促旋酶相互作用的功能结构域，揭示了革兰阴性细菌中Qnr蛋白和DNA促旋酶相互作用的一种普遍机制[19]。为获得哈维氏弧菌的Qnr蛋白，本研究扩增了哈维氏弧菌染色体上qnr基因，得到一段长为651 bp的序列，并将其在大肠杆菌里表达，获得带有标签蛋白的融合蛋白。选用的表达系统为大肠杆菌pET32表达系统，载体含有噬菌体T7启动子，可在含有T7噬菌体RNA聚合酶基因（位于λ 噬菌体DE3区）的BL21(DE3)菌株中表达外源蛋白，具有转化效率高、生长繁殖快、操作简单等优点[23-24]。此外，重组蛋白的表达水平还与诱导条件有关，如温度、诱导时间和IPTG浓度等[25]。为提高表达水平，优化此3方面的表达条件，结果发现，低温条件下获得的蛋白较多，且更易获得活性蛋白，这可能是由于低温可降低细菌生长速度，增加重组质粒拷贝数，最终增加融合蛋白的表达量，且低温有助于蛋白正确折叠，高温下易形成包涵体。本研究中，在诱导6 h后蛋白表达量最高，之后随着诱导时间增加，蛋白表达量反而下降，这说明诱导时间并非越长越好。原因可能是随着诱导时间延长，细菌次生代谢产物增多，培养基营养物质大量消耗，不利于外源蛋白的积累。而IPTG浓度对重组蛋白的表达量影响不大，在低浓度（0.05 mmol/L）下即可获得大量蛋白。最终确定的表达重组蛋白的最佳条件为：在28 ℃、IPTG浓度为0.05 mmol/L条件下诱导6 h。所得哈维氏弧菌Qnr蛋白为进一步研究蛋白纯化，蛋白的结构和功能以及细菌的耐药机制奠定基础，并为发现新型的喹酮类耐药基因和蛋白提供一定依据。

参考文献

[1]李洋,李强,张显昱.哈维弧菌及其主要致病因子的研究进展[J].中国农业科技导报,2014,16(4):159-166.

[2]张晓华,钟英斌,陈吉祥.哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学及检测技术[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2007,37(5):740-748.

[3]AUSTIN B,ZHANG X H.Vibrio harveyi:a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates[J].Letters in Applied Microbiology,2006,43(2):119-124.

[4]LOPEZ J R,DE LA ROCA E,NUNEZ S,et al.Identification of Vibrio harveyi isolated from diseased cultured wedge sole Dicologoglossa cuneata[J].Diseases of Aquatic Organisms,2009,84(3):209-217

[5]PIZZUTTO M,HIRST R G.Classification of isolates of Vibrio harveyi virulent to Penaeus monodon larvae by protein profile analysis and M13 DNA fingerprinting[J].Dis Aquat Organ,1995,21(1):61−68.

[6]LIU P C,LEE K K,YII K C,et al.Isolation of Vibrio harveyi from diseased kuruma prawns Penaeus japonicus[J].Current Microbiol,1996,33(2):129-132.

[7]VANDENBERGHE J,VERDONCK L,ROBLES AROZARENA R,et al.Vibrios associated with Litopenaeus vannamei larvae,postlarvae,broodstock,and hatchery probionts[J].Applied Environment Microbioltic,1999,65(6):2592-2597.

[8]写腊月,胡琳琳,房文红,等.海水养殖源弧菌耐药性调查与分析[J].海洋渔业,2011,33(4):442-446

[9]高玉龙,冯娟,苏友禄,等.广东阳江市闸坡网箱养殖区弧菌耐药性分析[J].海洋环境科学,2014,33(1):32-35.

[10]曾德乾,冯娟,徐力文,等.海水养殖鱼哈维弧菌分离株的耐药谱型分析[J].中国水产科学,2015,12(1):129-138.

[11]LUO Peng,JIANG Hai-ying,WANG Yan-hong,et al.Prevalence of mobile genetic elements and transposase genes in Vibrio alginolyticus from the southern coastal region of China and their role in horizontal gene transfer [J].International Microbiology,2013,15(4):199-208.

[12]娄阳,张昭寰,肖莉莉,等.食品源抗生素抗性基因的来源与分布状况研究进展[J].食品工业科技,2015,36(12):368-374.

[13]MARTÍNEZ-MARTÍNEZ L,PASCUAL A,JACOBY G A.Quinolone resistance from a transferable plasmid [J].Lancet,1998,351:797-799.

[14]JACOBY G A,HOOPER D C.Phylogenetic analysis of chromosomally determined qnr and related proteins [J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(4):1930-1934.

[15]POIREL L,LIARD A,RODRIGUEZ-MARTINEZ J M,et al.Vibrionaceae as a possible source of Qnr-like quinolone resistance determinants[J].The Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2005,56(6):1118-1121.

[16]CATTOIR V,POIREL L,MAZEL D,et al.Vibrio splendidus as the source of plasmid-mediated QnrS-like quinolone resistance determinants [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2007,51(7):2650-2651.

[17]SANCHEZ M B,HERNANDEZ A,RODRIGUEZ-MARTINEZ J M,et al.Predictive analysis of transmissible quinolone resistance indicates Stenotrophomonas maltophilia as a potential source of a novel family of Qnr determinants [J].BMC Microbiology,2008,8:148.

[18]WANG Ming-hua,GUO Qing-lan,XU Xiao-gang,et al.New plasmid-mediated quinolone resistance gene,qnrC,found in a clinical isolate of Proteus mirabilis[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2009,53(5):1892-1897.

[19]XIONG X,BROMLEY E H,OELSCHLAEGER P,et al.Structural insights into quinolone antibiotic resistance mediated by pentapeptide repeat proteins:conserved surface loops direct the activity of a Qnr protein from a gram-negative bacterium [J].Nucleic Acids Research,2011,39(9):3917-3927.

[20]PONS M J,GOMES C,RUIZ J.Qnrvc,a new transferable Qnr-like family [J].Enfermedades Infecciosasy Microbiologia Clinica,2013,31(3):191-192.

[21]GIBELLO A,DE ALBA P D,BLANCO M M,et al.Lactococcus garvieae carries a chromosomally encoded pentapeptide repeat protein that confers reduced susceptibility to quinolones in Escherichia coli producing a cytotoxic effect [J].Research in Microbiology,2014,165(7):590-599.

[22]党宏月,宋林生,张志南.海水养殖环境细菌耐药性的危害[J].海洋科学集刊,2006,47(4):29-40.

[23]解庭波.大肠杆菌表达系统的研究进展[J].长江大学学报(自科版医学卷),2008,5(3):77-82.

[24]王靖瑶,王天女,卢磊,等.大肠杆菌Ⅰ型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略[J].中国生物工程杂志,2014,34(6):98-104.

[25]SPRENSEN H P,MORTENSEN K K.Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli[J].J Biotechnol,2005,115:113-128.

（责任编辑：刘庆颖）

Cloning and Optimization of Prokaryotic Expression of Quinolone Resistance Gene in Vibrio harveyi

ZHOU Wei1,2,TANG Ju-fen1,2,GAO Zeng-hong1,GAN Zhen1,2,JIAN Ji-chang1,2,WU Zao-he2,3,DING Yu1,2
(1.Fisheries College of Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088,China; 3.Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China)

Abstract:The sequence of quinolone resistance gene of Vibrio harveyi was cloned based on the qnr of Vibrio harveyi published on GenBank and then inserted into the pET-32a vector to construct prokaryotic expression plasmid pET32-qnr.Then the expression conditions of temperature,induction time,and IPTG concentration of the pET32-qnr were optimized.The results showed that the complete open reading frame(ORF)length of qnr gene was 651 bp,encoding a protein of 216 amino acids.The optimization conditions of inducible expression for Qnr protein were inducing in 0.05 mmol/L IPTG for 6 hours at 28 ℃.

Key words:Vibrio harveyi; quinolone resistance gene; prokaryotic expression; optimization

通信作者：丁燏（1971－），男，博士，教授，研究方向为水产经济动物免疫学及病害控制。E-mail：dingy@gdou.edu.cn

基金项目：农业部行业专项，渔药使用风险评估及其控制技术研究与示范（201203085）; 广东省教育厅高等学校高层次人才项目(谷胱甘肽及其合成酶系在哈氏弧菌耐药中的作用机制研究)。

收稿日期：2015-10-08

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.016

中图分类号：Q786;Q939.1

文献标志码：A

文章编号：1673-9159（2016）01-0093-05

第一作者：周维（1990－），女，硕士研究生，研究方向为水产经济动物病害防治。E-mail：zw199008 @163.com