广豆根总黄酮的超声提取工艺及抗氧化活性

兰艳素， 王爱东， 牛江秀（黄山学院化学化工学院，安徽黄山245041）



广豆根总黄酮的超声提取工艺及抗氧化活性

兰艳素， 王爱东， 牛江秀
（黄山学院化学化工学院，安徽黄山245041）

摘要：目的 以广豆根为原料，利用星点设计-响应面法研究其中总黄酮的超声提取工艺，然后进行抗氧化活性测试。方法 以乙醇体积分数、超声提取时间、液料比为考察因素，进行3因素5水平星点试验设计，响应面分析法优化广豆根中总黄酮的提取工艺，DPPH法研究纯化前后总黄酮的自由基清除能力。结果 最佳工艺为乙醇体积分数80%，提取时间30 min，液料比20∶1（mL/g）。在此条件下，黄酮得率为12.71 mg/g，与模型预测值相符。而且，纯化前后的广豆根总黄酮对DPPH自由基均具有较强的清除能力。结论 该工艺简单、可行，而且总黄酮提取物具有明显的抗氧化活性，是一种天然的抗氧化剂。

关键词：广豆根；总黄酮；超声提取；星点设计-响应面法；抗氧化活性

广豆根为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根及根茎，是清热解毒、利咽消肿的传统中药［1］，临床上经常用于治疗咽喉炎、心律失常和黄疸等病症［2］，含有黄酮、生物碱、三萜、甾醇［3］以及微量元素［4］等成分，前期已对其中的化学成分进行分离，结果首次从中分离得到10个已知黄酮类化合物［5］以及1个新黄酮类化合物［6］。据报道，很多药材中均含有黄酮类化合物，是常见的药效成分之一，具有很多的药理活性，如抗病毒、抗氧化等，还可有效改善血管的渗透性［7］。因此，从广豆根中提取总黄酮具有很好的应用前景。

星点设计是一种能将数学和统计方法融于一体的新型试验方法，既能克服正交试验设计精度不够、操作繁琐等缺陷，而且对实验结果的预测性较好［8］，故常被应用于中药有效成分（黄酮、生物碱、皂苷、三萜类等）的提取工艺、处方优化等领域［9-10］。本实验采用超声法辅助提取，星点设计-响应面法优化广豆根中总黄酮的提取工艺，并探讨其抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料 广豆根采自安徽岭南自然保护区，经黄山学院生命与环境科学学院方建新老师鉴定为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根及根茎。芦丁对照品（批号10080-200707，中国食品药品检定研究院）；DPPH· （1，1-二苯基苦基苯肼，美国）。乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、抗坏血酸均为分析纯。

1.2 仪器 UV-2600紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ-300VDV超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TG-165台式高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 广豆根中总黄酮提取工艺流程 广豆根→60℃烘干→粉碎→80%乙醇浸泡0.5 h→超声波提取→冷却→离心15 min→总黄酮提取物。

1.3.2 标准曲线的制作 精密称取12.3 mg芦丁对照品，烘箱中干燥12 h，完全溶解后定容于50 mL量瓶中，即得芦丁对照品溶液。参考文献［11］中的紫外分光光度法，并略做改动。移取不同体积的芦丁对照品溶液，依次加入NaNO2、A1（NO3）3和NaOH溶液进行显色，空白溶液调零，在510 nm波长处测定吸光度（A）值，得标准曲线方程A＝10.107χ＋0.045 9，R2＝0.999 5，表明线性关系达到试验要求。

1.3.3 广豆根总黄酮的提取及含量测定 称取1.0 g干燥的广豆根粉末，转移至100 mL圆底烧瓶中，按试验设计加入一定体积分数的乙醇溶液，接上冷凝回流装置，浸泡0.5 h，超声（300 W、45 Hz）辅助提取一定时间。样品溶液经过冷却、离心后，移取上层清液7 mL，适当稀释，然后按“1.3.2”项下方法进行显色操作，最后紫外分光光度计测定溶液的吸光度值，代入标准曲线方程，计算总黄酮含有量，从而得到其提取率，公式如下。

其中，C为稀释后溶液的黄酮质量浓度（mg/mL）；M为样品质量（g）；V为离心后的上层溶液体积（mL）；N为稀释的倍数。

1.4 单因素试验 称取干燥的广豆根粗粉1.0 g，共19份，分别转移至100 mL圆底烧瓶中，依次以乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（mL/g，10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1）、提取时间（10、15、20、25、30、35、40 min）为因素，在50℃提取温度下超声（300 W、45 Hz）提取，提取液经冷却、离心、稀释等处理后，按照“1.3”项下方法测定溶液吸光度值，考察以上3个因素对总黄酮提取率的影响。

1.5 方法学考察

1.5.1 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液1.0 mL，按照“1.3”项下方法显色后，测定溶液吸光度值。结果，ISD为0.95%（n＝5），表明仪器精密度良好。

1.5.2 稳定性试验 吸取稀释好的黄酮溶液5.0 mL，显色后每隔20 min测定一次溶液的吸光度值。结果，ISD 为1.16%（n＝9），表明样品溶液在3 h内测定稳定性较好。

1.5.3 重复性试验 称取广豆根粗粉1.0 g，在优化后的提取工艺条件下提取，提取液按“1.3”项下方法测定总黄酮的含有量，平行5次。结果，ISD为0.85%，表明该方法重复性良好。

1.5.4 加样回收率试验 精密量取5份在最优提取工艺条件下的提取液（总黄酮质量浓度为0.635 5 mg/mL），分别加入等体积芦丁溶液，依次加样后显色，测定溶液吸光度。结果，平均回收率为98.86%，ISD为1.08%，表明该方法回收率良好。

1.6 星点设计 综合考虑单因素试验结果，固定超声功率为300 W，频率为45 Hz，以乙醇体积分数、提取时间和液料比为考察因素，总黄酮提取率为响应值，进行星点实验设计，各因素分别用X1、X2、X3表示，结果见表1。

表1 星点设计因素与水平

1.7 广豆根总黄酮的抗氧化活性测定 精密称取冷藏避光存放的DPPH·固体19.9 mg，迅速用80%乙醇溶解，定容于250 mL棕色量瓶中，得到质量浓度为0.2 mo1/L的DPPH·溶液，避光冷藏保存。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对广豆根总黄酮提取率的影响 见图1。

图1 乙醇体积分数对广豆根总黄酮提取率的影响

由图可知，乙醇体积分数在60%～80%之间时，总黄酮提取率的变化非常明显，可能是因为该类成分大多为中、低极性；在80%时，总黄酮提取率最高，可达14.82 mg/g；在40%时，提取率最低，只有12.95 mg/g，最大值与最小值相差较大，表明乙醇体积分数对提取效果的影响相对较大。因此，确定乙醇体积分数为80%。

2.1.2 提取时间对广豆根总黄酮提取率的影响 见图2。

图2 提取时间对广豆根总黄酮提取率的影响

由图可知，当提取时间为10 min时，总黄酮得率最低，为12.74 mg/g；随着提取时间延长，得率缓慢增加；在30 min以后，曲线变平缓，而且稍有下调，可能是因为提取的时间过长会对黄酮成分的结构造成一定破坏。因此，确定提取时间为30 min。

2.1.3 液料比对广豆根总黄酮提取率的影响 见图3。

图3 液料比对广豆根总黄酮提取率的影响

由图可知，液料比在10∶1到15∶1（mL/g）之间的曲线较陡峭，总黄酮得率变化明显，说明加大溶剂量可较好地促进总黄酮的溶出；若液料比继续扩大，总黄酮量变化甚微，曲线不再上扬；当液料比为20∶1（mL/g）时，提取率最高。因此，确定液料比为20∶1（mL/g）。

2.2 设计试验与结果 见表2。

2.2.1 模型拟合 采用Design Expert软件，对试验数据进行分析，得到超声提取广豆根总黄酮的回归方程为Y＝12.75 -0.323 8X1＋0.070 6X2-0.254 6X3＋0.152 5X1X2-0.16X1X3＋0.342 5X2X3-0.800 4X21-0.347 8X22-0.561 7X23。然后，对其进行方差分析，结果见表3。

由表可知，X1和X3对总黄酮提取率的影响非常显著；超声提取时间的P值为0.115 1（＞0.05），说明提取时间对总黄酮得率的影响不显著；X21、X22、X23的P值都小于0.000 1，影响都非常显著。同时，液料比和提取时间的交互作用对总黄酮提取率的影响也很显著，而其余交互作用也有一定影响。

另外，失拟项的P值为0.369 4（＞0.05），影响不显著，说明试验所选的3个考察因素为主要影响因素，设计合理；所得模型的F值为82.96，P＜0.000 1，影响非常显著。因此，该模型优化得到的广豆根总黄酮提取工艺条件可靠、准确。

表2 试验设计与结果

表3 方差分析结果

2.2.2 效应面分析 见图4～6。

图4可见，提取时间与乙醇体积分数交互影响的响应曲面弯曲明显，提取时间30 min、乙醇体积分数80%处为曲线最高点。而且，曲线的左侧较平缓，说明提取时间对试验结果的影响较小。

图5可见，当提取时间固定，液料比在15∶1～25∶1 （mL/g）之间时，黄酮提取率缓慢增大，达到最高点后开始快速下降；当液料比不变，延长提取时间时，其变化不明显，说明该因素对黄酮得率的影响不如液料比。由此可知，在乙醇体积分数不变，液料比为20∶1（m L/g）的条件下提取30 min时，黄酮提取率最高。

图6可见，乙醇体积分数与液料比的交互作用曲面非常对称，而且弯曲度明显，可见其对广豆根总黄酮提取率的影响较大。随着液料比的上升以及乙醇体积分数的增加，曲线先上扬，后下调，当乙醇体积分数为80%，液料比为20∶1（mL/g）时，提取效果最好。

图4 提取时间与乙醇体积分数交互影响黄酮提取率的响应面图

图5 提取时间与液料比交互影响黄酮提取率的响应面图

图6 乙醇体积分数与液料比交互影响黄酮提取率的响应面图

2.3 验证试验 考虑到具体实验操作的可行性，尽可能将模型工艺参数取整修正。称取6份等质量的广豆根药材，在功率为300 W，频率为45 Hz，提取溶剂为80%乙醇，液料比为20∶1（mL/g）的条件下超声提取30 min，提取液处理后分别进行显色，然后测定。结果，总黄酮的平均得率为12.71 mg/g，与模型预测值相差不大，说明该模型可靠，可对广豆根中总黄酮的提取结果进行很好地预测。

2.4 抗氧化活性评价 按“1.7”项下方法进行试验，分别考察不同质量浓度（3.76～27.3 μg/mL）总黄酮提取物对DPPH·的清除作用，结果见图7。

图7 广豆根总黄酮对DPPH·的清除作用

由图可知，广豆根粗提物对DPPH·具有一定的清除能力，其清除率曲线位于VC之下。总体来看，随着总黄酮质量浓度的升高，清除能力也随之增强，呈现一定的线性关系，广豆根粗提物的线性方程为y＝2.716χ＋7.123 7 （R2＝0.986 1），IC50为15.79 μg/mL；VC的线性方程为y＝2.879 3χ＋19.434（R2＝0.942 7），IC50为10.62 μg/mL，可见总黄酮粗提液对DPPH·的清除能力稍弱于VC，当前者质量浓度大约为后者的1.49倍时，对DPPH·具有同等的抑制能力。同时还发现，经过AB-8大孔树脂纯化后，黄酮提取液的抗氧化活性得到了明显增强，对DPPH·的清除率稍高于VC，表明安徽岭南产的广豆根具有较强的抗氧化活性。

3 结论

预试验分别采用乙醇回流法和超声法提取广豆根中总黄酮，并比较两者的提取效果。结果表明，超声提取技术可使总黄酮较好、较快地溶出，具有提取时间短、提取效率高等优点，而且在提取温度也不高，可尽量避免由于长时间加热或者高温对有效成分结构的破坏，故本实验选用超声法进行提取。另外，为了减小由于乙醇挥发所带来的误差，最好使用带有冷凝回流的提取装置。

而且，效应面分析法所得模型的显著性较高。在选取的3个考察因素中，影响最明显的是乙醇体积分数，其次为液料比。最优工艺参数为乙醇体积分数80%，提取时间30 min，液料比20∶1（mL/g），该条件下总黄酮得率为12.71 mg/g，方法简便、可行。

然后，考察在最佳提取工艺条件下得到总黄酮提取物以及经AB-8大孔树脂纯化后的总黄酮对DPPH·的清除能力。结果表明，安徽岭南产的广豆根药材中总黄酮成分对自由基的清除率较高，抗氧化作用较好，研究开发前景可观。

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作者简介：兰艳素（1985—），女，硕士，助教，从事天然产物提取分离与活性研究。Te1：13685595775，E-mai1：1s7536858@163.com

基金项目：安徽高校省级优秀青年人才基金重点项目（2013SQIL088ZD）；安徽省自然科学基金项目（1308085QH139）；黄山学院自然科学基金项目（2011xkj017）

收稿日期：2015-01-28

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.050

中图分类号：I 284.2

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）03-0698-05