UPLC法测定栀子中的4种成分

2016-04-06石燕红陈绍成上海中医药大学中药学院上海00重庆市三峡天然药物研究所重庆404000重庆第二师范学院生物与化学工程系重庆400067

中成药 2016年3期

钱珺，石燕红，陈绍成，王瑞 *（.上海中医药大学中药学院，上海00；.重庆市三峡天然药物研究所，重庆404000；.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆400067）

UPLC法测定栀子中的4种成分

钱珺1，石燕红2，陈绍成3，王瑞1 *
（1.上海中医药大学中药学院，上海201203；2.重庆市三峡天然药物研究所，重庆404000；3.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆400067）

摘要：目的建立超高效液相色谱（UPLC）法同时测定栀子中京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2的含有量。方法分析采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱；检测波长238 nm和440 nm；体积流量0.3 mL/min；柱温30℃。结果京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2分别在0.016～0.510 mg/mL（r＝0.999 9）、0.032～1.020 mg/mL（r＝0.999 9）、0.016～0.515 mg/mL（r＝1.000 0）和0.002～0.063 mg/mL（r＝0.999 9）范围内线性关系良好，平均回收率分别为98.5%、99.0%、100.1%、100.9%，ISD分别为1.2%、1.4%、1.6%、1.7%。结论该方法简便快速，重复性好，可为栀子质量评价提供参考。

关键词：栀子；京尼平龙胆二糖苷；栀子苷；西红花苷-1；西红花苷-2；UPLC

栀子为茜草科植物栀子Gardenia Jasminoides E11is的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒以及外用消肿止痛的功效［1］，而炒栀子、焦栀子为栀子的加工炮制品，苦寒之性较弱，更适于脾胃虚弱者［2］。栀子所含化学成分有环烯醚萜、二萜（西红花苷）、有机酸、黄酮、香豆素、挥发油、皂苷、木脂素、多糖等，其中具有较强药理活性者主要为环烯醚萜类及西红花苷类［3-5］。目前，已有文献报道用高效液相色谱（HPLC）法，以这两类成分为指标，对栀子进行质量评价，但分析时间较长［6-10］。

本实验采用超高效液相色谱（UPLC）技术，建立双波长法同时测定栀子及其炮制品中2个环烯醚萜类成分（京尼平龙胆二糖苷、栀子苷）和2个西红花苷类成分（西红花苷-1和西红花苷-2）的方法，其简便可靠，分析时间短，能显著提高分析效率，可为栀子的质量评价提供参考。

1 仪器与试药

Waters Acquity超高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动进样器、PDA检测器和Empower工作站（美国Waters公司）；AE200电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

乙腈、磷酸为色谱纯（德国Merck公司）；水为超纯水（美国Mi11ipore公司产品所制）；其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。栀子苷（批号110749-201316）、西红花苷-1（批号111588-201303）、西红花苷-2对照品（批号111589-201304）和栀子对照药材（批号120986-201307）均购自中国食品药品检定研究院；京尼平龙胆二糖苷对照品（批号ZM0507BA14，纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司。30批生栀子、2批炒栀子和2批焦栀子均为市售品和产地收集，经重庆第二师范学院陈晓麟教授鉴定为茜草科植物栀子Gardenia Jasminoides E11is的干燥成熟果实，见表1。

表1 不同批次栀子样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～3 min，8%～20%A；3～8 min，20%～35%A）；检测波长238 nm（0～5 min）、440 nm（5～8 min）；体积流量0.3 mL/min；柱温30℃；进样量2 μL。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备精密称取京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2对照品适量，加甲醇制成每1 mL含京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1、西红花苷-2 80、250、40和10 μg的溶液，即得。

图1 混合对照品和栀子的UPLC色谱图

2.3 供试品溶液制备精密称取样品粉末0.2 g（过4号筛），置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声提取（250 W、40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，70%甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察精密称取京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2对照品适量，置于20 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为0.510、1.020、0.515、0.630 mg/mL的对照品储备溶液。再精密吸取不同储备液，稀释成系列质量浓度的溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，进样2 μL，以对照品质量浓度（mg/m L）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，回归方程和线性范围见表2。由表可知，各化合物在相应质量浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验精密称取样品粉末（批号ZZ-15052830）1份（0.2 g），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，测得京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2峰面积的ISD分别为0.2%、0.2%、0.2%和0.9%，表明仪器精密度良好。

表2 回归方程及线性范围

2.6 重复性试验精密称取样品粉末（批号ZZ-15052830）6份，每份0.2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测得京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2平均含有量分别为1.54%、5.18%、0.86%、0.08%，ISD分别为1.1%、0.9%、1.3%、1.6%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验精密称取样品粉末（批号ZZ-15052830）1份（0.2 g），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24、48、72 h进样，测得京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2峰面积的ISD分别为0.6%、0.6%、0.8%和1.1%，表明供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验精密称取含有量已知的样品粉末（ZZ-15052830）9份，每份0.1 g，分别按样品含有量的50%、100%和150% 3个水平加入京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算加样回收率，结果见表3。

2.9 样品测定精密称取样品粉末0.2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2的含有量，结果见表4。

3 讨论

本实验应用PDA检测器，分别对4个指标成分（京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-1和西红花苷-2）对照品溶液进行全波长扫描，发现京尼平龙胆二糖苷和栀子苷的最大吸收波长为238 nm，而西红花苷-1和西红花苷-2为440 nm。此外，前2个成分的出峰时间为2～5 min，而后2个成分为5～8 min，故添加波长切换时间，使检测波长在5 min后自动切换，建立的可变波长UPLC法可以同时测定栀子及其加工炮制品中4个指标成分的含有量。目前文献报道，采用HPLC法对栀子中环烯醚萜类和西红花苷类成分进行含有量测定，分析时间在45 min以上，而本实验中UPLC法的一次分析时间仅需8 min，大幅缩短分析时间，提高了分析效率。

栀子为常用大宗药材，江西、四川、重庆和湖南为全国四大栀子产地。本实验所用样品来自江西、四川、重庆、湖南、湖北、福建、河北、河南、山东和浙江10个地区，测定结果表明，京尼平龙胆二糖苷含有量为0.33%～1.72%，栀子苷为1.59%～5.90%，西红花苷-1为0.19%～1.26%，西红花苷-2为0.04%～0.17%。

现行《中国药典》2015版以栀子苷为指标性成分，规定栀子中其含有量不得低于1.8%，炒栀子中不得低于1.5%，焦栀子中不得低于1.0%。本实验收集的样品中除1批生栀子（批号ZZ-15090105）不合格外，其他样品中栀子苷的含有量均明显高于药典规定标准。

同时，栀子还是重要的食用色素和天然染料原料，被广泛应用于食品、化工等行业。药典规定，栀子在9～11月果实成熟，呈红黄色时采收，“表面红黄色或棕红色”为栀子中西红花苷类成分的外观性状指示，说明其也是栀子品质优良的重要指标之一［11］。含有量测定结果表明，西红花苷-1为生栀子中主要的西红花苷类成分，含有量越高，栀子表面颜色越红。其含有量低的样品外观颜色为灰棕色或棕黄色，而含有量高的样品外观颜色为红黄色，甚至棕红色。