基于X射线衍射指纹图谱鉴别龙骨

崔晓慧， 陈 龙， 刘义梅， 黄必胜， 陈科力（湖北中医药大学，教育部中药资源和中药复方重点实验室，湖北武汉430065）



基于X射线衍射指纹图谱鉴别龙骨

崔晓慧， 陈 龙， 刘义梅， 黄必胜， 陈科力*
（湖北中医药大学，教育部中药资源和中药复方重点实验室，湖北武汉430065）

摘要：目的 建立X射线衍射指纹图谱对龙骨进行鉴别。方法 应用粉末X射线衍射技术，对11批龙骨和3批煅龙骨样品进行分析，以优质龙骨样品的X射线衍射平均图谱为对照指纹图谱，以共有特征峰为指纹峰，进行相似度评价和聚类分析。结果 以样品的相关系数为相似度评价指标，龙骨正品的相似度大于0.83，而聚类分析结果亦可将正伪龙骨区分开，但这两种方法不适用于关节处龙骨的鉴别。结论 该指纹图谱可用于对龙骨的真伪鉴别，关节处除外。关键词：龙骨；X射线衍射；指纹图谱；相似度评价；聚类分析

KEY W 0RDS：Os Draconis；X-ray diffraction；fingerprint；simi1arity eva1uation；c1uster ana1ysis

龙骨（Os Draconis）为古代哺乳动物，如三趾马、犀类、鹿类、牛类、象类等骨骼的化石或象类门齿的化石［1］，其性味甘、涩、平，归心、肝、肾、大肠经［2］，生用可平肝潜阳、镇惊安神，主治烦躁易怒、心悸失眠、头晕目眩、癫狂惊厥等症；煅用可收敛固涩，主治遗精早泄、崩漏、虚汗、湿疮痒疹、疮口不敛及外伤出血等症［3］，其主要成分为碳酸钙、磷酸钙，另含少量的铁、镁、铝、钾、钠、氯、硫酸根等离子［4］。由于龙骨为动物骨骼多年形成的化石，是宝贵的不可再生资源，故现存量逐年减少，正品价格不断增高，伪劣产品较多，如用风化的动物骨骼外包滑石粉或石炭粉来冒充龙骨［5］，而且骨骼在漫长的年代转化为化石期间，还有很多中间类型，因此龙骨是市场上伪劣药材较多的中药品种之一。对于龙骨这类化石类药材的鉴别，主要是依靠经验性的性状分析，其主观性较强，一旦其被粉碎成粉末后，就很难再用常规的方法加以鉴别。因此，为保证药材的质量，确保临床疗效，运用现代分析技术建立龙骨可靠的客观鉴定方法是很有必要的。

X射线衍射法是分析和研究结晶物质的重要手段之一，由于矿物类中药绝大多数由晶质矿物组成，因此采用该方法进行鉴定具有可行性［6-10］，文献［11］对龙骨和龙齿建立了指纹图谱以进行初步分析，并对真伪品进行了鉴定。通过比较发现，两者的X射线衍射指纹特征有比较明显的区别，故应当分别建立更为精细的指纹图谱。但是，该文献中生龙骨的样品太少（只有2份），而且其图谱分析尚未对市场上多种龙骨样品的形式进行解读。因此，本实验采用X射线衍射法，对11批不同来源的龙骨及煅龙骨样品进行分析，在建立正品龙骨X射线衍射指纹图谱的基础上，与各种龙骨样品进行比较，并作进一步的分析研究。

1 材料与仪器

1.1 药材 从不同药材市场购得11批龙骨样品，均由湖北中医药大学中药鉴定教研室陈科力教授依据其性状，进行了初步鉴别，详细信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Inform ation of sam p les

1.2 仪器 X’PertPro型X射线粉晶衍射仪（荷兰帕纳科公司）；MID Jade6.5分析软件；Origin8数据分析和绘图软件。

2 方法与结果

2.1 样品制备 分别取11批龙骨样品，干燥，粉碎，过200目筛，制成待测样品。

煅制方法为将样品S3、S4和S5的粉末置于坩埚内，再放到650℃马弗炉中，2 h后取出冷却，标记为样品D3、D4和D5。

2.2 实验条件及X射线衍射图谱采集 入射光源为CuKα辐射；Ni片滤波；X光管工作电压为40 kV；电流为40 mA；光阑系统为DS＝SS＝1°；IS＝0.3 mm。使用连续扫描方式，扫描速率为8°/min；2θ分辨率为0.02°；扫描范围为3°～65°；采用超能探测器。

取少量样品粉末，用玻璃板压平于样品板的凹槽中，按照仪器操作程序，采集各样品粉末的X射线衍射原始图谱，并导入MID Jade 6.5分析软件中，对图谱做11点平滑处理，得到各样品的分析图谱。

2.3 龙骨样品的X射线衍射图谱特征及分析

2.3.1 优质龙骨 应用Origin 8软件处理，绘制S1～S4共4批优质龙骨样品的X射线衍射共有模式图，见图1，发现其几何拓扑图形规律一致。利用JADE 6.0数字信号处理技术，对这些图谱分别进行寻峰、物相检索，查阅由国际粉末衍射标准联合会负责编辑出版的“粉末衍射卡片PDF卡片”，初步判断这其X射线衍射数据与PDF74-0565 （hydroxy1apatite）及PDF72-1937（ca1cite）基本一致，说明这些优质龙骨样品主要含Ca10（PO4）6（OH）2（羟基磷灰石）与CaCO3（方解石型碳酸钙），这与文献［11-12］报道相符。另外，样品S3与其他样品相比，在2θ＝26.639°处多一个谱峰，与PDF79-1906一致，是石英（SiO2）的特征峰，其相对峰面积为34%，表明该样品中石英含有量较低。将这4批优质龙骨X射线衍射图谱中的峰叠加后平均，得到平均数图谱，作为龙骨的对照图谱，见图2。由图可知，2θ＝26.639°处是石英（SiO2）的特征峰，而并非龙骨的特征峰，故将其去掉。

图1 4批龙骨正品的X射线衍射指纹图谱Fig.1 X-ray diffraction fingerprints of four batches of genuine Os Draconis

图2 4批龙骨正品的平均数图谱Fig.2 M ean spectrum of four batches of genuine Os Draconis

2.3.2 关节位置处龙骨图谱 样品S5、S6为关节处龙骨，初步鉴定为龙骨正品，其X射线衍射图谱的几何拓扑图形规律一致，见图3。物相检索结果表明，这2批龙骨样品主要含羟基磷灰石与少量石英，不含方解石，与优质龙骨在物相组成和标准指纹图谱上有较大差异，说明可能为龙骨伪品。但对已确证为龙骨的S3样品关节部分S3-2的X射线衍射图谱进行分析，发现其物相组成也与S5、S6完全一致，也含少量石英，不含方解石，即两者也可能为龙骨正品。故根据X射线衍射图谱，对S5、S6的鉴定结果为“龙骨存疑”，所以该方法不适合关节处龙骨样品的鉴别，还有待作深入的探讨。

2.3.3 煅龙骨 3批煅龙骨的X射线衍射图谱见图4。比较龙骨和煅龙骨的物相组成，发现D3与S3一样，主要为羟基磷灰石与方解石，还含很少量的石英；D4与S4一样，主要含羟基磷灰石与方解石；D5与S5一样，主要含羟基磷灰石和少量石英，表明龙骨煅烧前后物相组成无明显变化。比较龙骨煅烧前后的峰形发现，煅烧前，羟基磷灰石的特征峰钝而宽，弥散严重［13-14］，说明该物相纯度及结晶度较低；煅烧后，各衍射峰强度增强，底部宽度变窄，峰形变尖锐，说明煅烧后样品的晶化程度大大提高。

图3 2批关节处龙骨的X射线衍射图谱Fig.3 X-ray diffraction fingerprints of tWo batches of Os Draconis in joints

图4 3批煅龙骨的X射线衍射图谱Fig.4 X-ray diffraction fingerprints of three batches of calcined Os Draconis

2.3.4 龙骨劣质品及掺伪品 样品S7呈圆柱状，石化明显，表面有黏土，骨髓腔处被大量岩石填充，滴加稀盐酸后迅速产生大量气泡，故鉴定为骨髓腔填充岩石的龙骨，即劣质龙骨，其X射线衍射图谱（图5）亦反映出该样品的龙骨组分特征。另外，其2θ＝29.413°（晶面间距d＝3.034 2 Å）处有一基峰（相对峰高I/I0＝100%），为方解石特征，表明该样品含大量方解石，主要来自髓部填充的岩石；2θ＝26.639°（d＝3.343 5 Å）处有一尖峰，为石英特征，可推测其来自样品表面附着的黏土。样品S8、S9均为经过粉碎处理后的龙骨统货，性状特征不明显，但仔细挑选后可见龙骨碎块，亦有大量表面光滑、无石化特征的现代动物骨头碎片，以及形如龙骨碎片的黏土块，而且后者亦发现一些表面包裹一层龙骨粉黏土块掺伪物，故两者也为龙骨伪品，其X射线衍射图谱见图5。通过物相检索，发现这2批样品均有羟基磷灰石和方解石，为龙骨正品的主要成分，同时均含有大量石英，其衍射强度大于主要成分。另外，样品S9还含有其他杂质矿物，如长石、石膏。

图5 3批龙骨伪品的X射线衍射图谱Fig.5 X-ray diffraction fingerprints of three batches of pseudo Os Draconis

2.3.5龙骨伪品的图谱分析 龙骨样品S10、S11无石化特征，故为伪品，其X射线衍射图谱见图6。通过物相检索发现，样品S10主要含羟基磷灰石和少量石英，不含碳酸钙，由于羟基磷灰石的特征峰峰形尖锐，分裂明显，与煅烧品类似，故推断其为伪品；S11主要含羟基磷灰石，不含CaCO3，峰形弥散严重，样品结晶性差。

2.4 龙骨XID图谱指纹性分析

2.4.1 X射线衍射图谱寻峰处理 利用JADE 6.0软件，对4批优质龙骨的图谱分别进行寻峰处理，经分析比较，选取强度较大的共有特征峰10个（图2）作为龙骨特征指纹峰。然后，对其他样品寻峰，得到各峰位值（2θ/°）和相对强度（I/I0），数据见表2。

表2 共有特征峰的峰位与相对强度Tab.2 Peak positions and relative intensities of common characteristic peaks

2.4.2 相似度计算 以图2中4批龙骨正品的平均数图谱为对照图谱，采用相关系数法和夹角余弦法分别计算各批龙骨的相似度，结果见表3。由表可知，各类样品的相似度由大到小依次为优质龙骨、优质煅龙骨、掺伪品、劣质品、伪品及关节处龙骨，可明显加以区分。

表3 各批龙骨的相似度Tab.3 Sim ilarities of various batches of Os Draconis

2.5 聚类分析方法验证 根据表3中各批龙骨样品的10个共有峰数据，采用SPSS 19.0软件进行系统聚类分析，结果见图7。由图可知，所有样品被聚为两类，样品S1、S2、S3、S4、D3、D4、S7聚为一类，均为正品龙骨，包括骨髓腔中充填了岩石的S7，其中S1、S3，S2、S4，D3、D4当距离标尺为1时，紧密相聚；样品D5、S5、S6、S8、S9、S10、S11聚为另一类，包括掺伪品S8、S9，伪品S10、S11，关节处样品D5、S5、S6，其中S8、S9紧密聚类，其它聚为一类，说明关节处的龙骨样品与伪品较难区分。以上结果与相似度分析基本一致，可用以明显鉴别除关节处的各类龙骨样品，也说明X射线衍射指纹图谱可用于龙骨品质评价及真伪鉴别。

3 讨论

本实验对不同来源的11批龙骨样品和3批煅龙骨样品进行性状鉴定和X射线衍射分析，建立了以4批优质龙骨样品平均图谱的10个共有特征峰为对照的龙骨X射线衍射指纹图谱，可准确区分优质、劣质、掺伪、伪品等不同品质的龙骨及煅龙骨。

图7 聚类分析图Fig.7 Cluster analysis chart

实验发现，相关系数法计算得到的相似度比夹角余弦法的差异更显著，故采用相关系数法考察该指纹图谱。结果，样品S1、S2、S3、S4、D3、D4的相关系数均在0.83以上，为优质龙骨，而且煅品均小于生品，两者可明显区分。在优质龙骨中，样品S3的相关系数偏低，其表面有少量黏土，可能在制样过程中掺入；掺伪品的相似度略低于煅品（＜0.81），但大于劣质品S7（0.701 3），说明掺伪品的质量比劣质品好，这与其性状特点相符。人为掺杂其他杂质的掺伪品中依然以优质正品龙骨为主，但S7天然伴生杂质的含有量却大于药用部位，致使其品质较掺伪差。研究发现，关节处龙骨及其煅品因与伪品在物相组成上都不含方解石，相似度均较低（＜0.55），所以不能通过相似度法区分开，这一结果也通过X射线衍射图谱的聚类分析法得到了印证。由于在实际销售和临床使用中，并不存在将关节处龙骨单独列出的情况，而是共同使用，故为避免其干扰，在应用X射线衍射指纹图谱鉴别龙骨时，应避开关节处。

在聚类分析中还发现，当距离标尺为3时，劣质品S7与优质龙骨聚为一类，结合其性状特点及物相组成，可说明天然形成的劣质品性状及物相组成与优质品相似，仅各物相含有量存在差异，而掺伪品中带入其他杂质，对药材品质的影响更大。因此，对于S7之类的掺伪龙骨可敲碎，剔除伴生杂质矿物后再使用。

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［综 述］

Identification of Os Draconis based on X-ray diffraction fingerprint

CUIXiao-hui， CHEN Long， LIU Yi-mei， HUANG Bi-sheng， CHEN Ke-1i*

（Key Laboratory of TraditionalChineseMedicineResourceand Compound Prescription，Ministry of Education，HubeiUniversity of ChineseMedicine，Wuhan 43OO65，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an X-ray diffraction fingerprint for the identification of Os Draconis.METH-0 DS The powder X-ray diffraction techno1ogy was used for ana1yzing e1even batches of Os Draconis and three batches of ca1cined Os Draconis.The simi1arity eva1uation and c1uster ana1ysisweremade with the average X-ray diffraction patterns of high qua1ity Os Draconis as reference fingerprint and common characteristic peaks as fingerprint peaks.RESULTS With the corre1ation coefficients of samp1es as eva1uation index，the simi1arity of genuine Os Draconis wasmore than 0.83，whi1e c1uster ana1ysis cou1d a1so distinguish genuine from pseudo Os Draconis.But these twomethods were not suitab1e for the identification of Os Draconis in joints.C0NCLUSI0N This fingerprint can be used for the identification of Os Draconis except joints.

*通信作者：陈科力（1947—），男，教授，博士生导师，研究方向为中药资源及其品质。E-mai1：ke1ichen@126.com

作者简介：崔晓慧（1979—），女，博士生，讲师，研究方向为中药资源及其品质。Te1：18971089410，E-mai1：53879185@qq.com

基金项目：武汉市2012年高新技术产业发展行动计划生物技术与新医药专项（201260523193）

收稿日期：2015-07-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.031

中图分类号：I282.5

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）03-0624-06