银黄口服液近红外光谱测定和相关性模型建立

张叶霞， 潘金火， 蔡宝昌， 秦昆明， 刘 晓，2， 王靥润， 严国俊*（.南京中医药大学药学院，江苏南京2002；2.南京中医药大学，国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏南京2002；.南京海昌中药集团有限公司，江苏南京2006）



银黄口服液近红外光谱测定和相关性模型建立

张叶霞1， 潘金火1， 蔡宝昌2，3， 秦昆明3， 刘 晓1，2， 王靥润1， 严国俊1*
（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.南京中医药大学，国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏南京210023；3.南京海昌中药集团有限公司，江苏南京210061）

摘要：目的 近红外光谱法测定银黄口服液（金银花、黄芩）中绿原酸和黄芩苷的含有量，并建立相关性模型用于定量分析。方法 采集30批银黄口服液的近红外光谱数据，HPLC和偏最小二乘法建立绿原酸和黄芩苷的相关性模型。结果 绿原酸和黄芩苷的最佳波段均为9 401.6～7 826 cm-1，I2分别为0.985 2和0.988 1，交叉验证均方差（IMSECV）分别为0.002 96和0.018，相对分析误差（IPD）分别为8.23和9.27。将该模型应用于检测两者的含有量时，其预测值的马氏距离（Mash distance）均小于1，相对误差分别为2.12%和1.67%。结论 该模型预测性良好，可用于银黄口服液的实时监测和质量控制。

关键词：银黄口服液；绿原酸；黄芩苷；相关性模型；近红外光谱；HPLC；偏最小二乘

KEY W 0RDS：Yinhuang Ora1 Liquid；ch1orogenic acid；baica1in；dependency mode1；near-infrared spectroscopy；HPLC；partia11east squares

银黄口服液由金银花和黄芩提取物加工制成，收载于《中国药典》2010版一部，具有清热解毒，疏风利咽功效，临床作用显著。其作为液体制剂，是许多中成药的中间体，如双黄连口服液，清开灵注射液［1-2］等，故优选其含有量测定方法对工业化生产具有重大意义。

近红外光谱分析技术是光谱测量技术和化学计量学的结合，因其简单可靠、快捷、无损，并可同时测定多组分，故可用于非破坏测定、在线分析等，迄今已应用于食品、药品、农业［3-9］等多个领域，具有巨大的发展空间和经济效应，可实现质量源于控制的理念。过程分析技术［10-14］是目前制药行业关注的热点，该方法旨在设计、分析和控制药品生产过程，通过及时测量原药材生产时物料和工艺过程的关键质量和性能指标，以确保终端产品的质量。由于近红外光谱技术无需对样品进行复杂的前处理，分析时间短，故为过程分析技术的常用工具之一。

本实验采用近红外光谱法，对银黄口服液进行定量分析，结合HPLC和偏最小二乘法，建立其主成分绿原酸和黄芩苷的相关性模型，从而为实现该药物工业化生产的全程实时质量监控提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 Waters 2000高效液相色谱仪，包括Waters 2996 DAD检测器、Epower 2.0色谱工作站（美国Waters公司）。Bruker-Tensor37傅里叶变换中、近红外光谱仪，包括OPUS 5.0光谱采集和处理软件、Pbs检测器（德国Bruker公司）；梅特勒MS-105DU电子分析天平（瑞士Mett1er-To1edo公司）。

乙腈、甲醇为色谱纯；95%乙醇为化学纯；甲酸、磷酸、盐酸、乙酸、氢氧化钠为分析纯；娃哈哈纯净水。

1.2 实验材料 绿原酸（批号110735-200212）、黄芩苷（批号110715-200212）对照品（中国食品药品检定研究院）。金银花、黄芩（江苏海昇药业有限公司）。共收集2个厂家不同批次的银黄口服液，见表1。

表1 银黄口服液的来源Tab.1 Sources of Yinhuang 0 ral Liquid

1.3 银黄口服液的样品制备

1.3.1 自制银黄口服液 参照《中国药典》2010版，按比例分别制得金银花和黄芩提取物，均符合国家标准。

1.3.2 HPLC法样品制备 取编号1～30的银黄口服液各10 mL，置于离心机中，20 000 r/min高速离心10 min，取上清液0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，密封冷藏保存。

1.3.3 NII法样品制备 取“1.2”项下30个样品，每个10 mL，置于10 mL量瓶中，摇匀，即得30批银黄口服液样品，密封冷藏保存。

1.4 绿原酸和黄芩苷的HPLC测定

1.4.1 色谱条件 Waters C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～7 min，12%～18%A；7～9 min，18%～28%A；9～16 min，28%～62%A；16～18 min，62%～100%A）；全波长扫描，绿原酸的检测波长为327 nm，黄芩苷的检测波长为280 nm；柱温30℃；进样量10 μL；体积流量1.0 mL/min。色谱图见图1。

图1 银黄口服液的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of Yinhuang 0 ral Liquid

1.4.2 标准曲线的制备 精密称取绿原酸对照品6.26 mg，甲醇定容至10 mL，再取1 mL，甲醇定容至10 mL，得质量浓度为0.062 6 mg/mL的储备液。再精密称取黄芩苷对照品5.11 mg，甲醇定容至10 mL，得质量浓度为0.511 0 mg/mL的储备液。

精密吸取上述对照品溶液2、4、8、12、16、20 μL进样，在“1.4.1”项色谱条件下测定。以各对照品进样量（μg）为横坐标（X），相应的峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得回归方程分别为绿原酸Y＝923 757X-22 822（r＝0.999 9），黄芩苷Y＝3 069 553X-628 015（r＝0.999 9）。

结果表明，绿原酸和黄芩苷分别在0.125 2～1.252 μg、1.022～10.22 μg范围内线性关系良好。1.4.3 精密度试验 分别精密吸取每1 mL含绿原酸0.062 6 mg、黄芩苷0.511 0 mg的对照品溶液10 μL，进样测定，连续6次。结果，两者ISD分别为0.78%和0.92%，表明仪器精密度良好。

1.4.4 稳定性试验 取同一样品溶液（批号131138）6份，按“1.3.2”项下方法制备样品溶液，于0、2、4、8、16、24 h进样10 μL，测定绿原酸和黄芩苷的含有量。结果，两者ISD分别为2.0%和2.2%，表明样品溶液在24 h内稳定。

1.4.5 重复性试验 取同一样品溶液（批号131138）6份，按“1.3.2”项下方法制备样品溶液，进样测定。结果，绿原酸和黄芩苷的平均含有量分别为7.38 mg/mL（ISD＝1.8%）和28.55 mg/mL （ISD＝0.89%），表明该方法重复性良好。

1.4.6 加样回收率试验（表2） 精密称取绿原酸、黄芩苷适量，用甲醇制成每1 mL含绿原酸0.121 mg和黄芩苷0.309 mg的混合对照品溶液。精密量取“1.3.2”项下批号为131138的银黄口服液1 mL，共6份，分别置于2 mL量瓶中，精密加入混合对照品溶液1 mL，甲醇定容至刻度，摇匀，静置30 min，进样测定。结果，两者平均加样回收率分别为96.1%（ISD＝1.1%）和97.4% （ISD＝1.7%），表明该方法加样回收率良好。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

1.5 银黄口服液近红外光谱测定 扫描范围14 000～3 900 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描16次，光程1 mm。平行3次，每次扫描30个样品，共90次，见图2。

图2 银黄口服液的近红外图谱Fig.2 Near-infrared image of Yinhuang 0 ral Liquid

2 结果与讨论

2.1 HPLC测定 取“1.3.2”项下溶液，共30批，分别精密吸取10 μL进样，测定各批次银黄口服液中绿原酸和黄芩苷的含有量范围。结果见表3。

表3 绿原酸和黄芩苷的含有量范围Tab.3 Content ranges of chlorogenic acid and baicalin

2.2 模型的建立与优化 将已扫描的样品光谱分成校正集和检验集两组。由于预测样品的浓度范围必须在所建模型内，故检验集样品从不同厂家和自制的银黄口服液中随机取样，用以检验所建模型的效果。余下的样品作为校正集样品，用以建立不同成分的近红外分析数学模型。

应用OPUS 5.0软件，对原始光谱进行平滑处理，优化用于建模的波段、光谱预处理方法，剔除预测值异常样品，偏最小二乘法对校正集进行交叉检验，再采用留一法进行内部交叉验证，确定模型主成分数，并对检验集样品进行模型外部预测。评价指标采用决定系数（I2）、交叉验证均方差（IMSECV）和相对分析误差（IPD），获得最佳光谱数据预处理方法、谱区范围和优化阶，见表4。

表4 优化模型参数Tab.4 Parameters for optim ized model

模型预测值与真实值的相关系数图见图3和图4。

图3 绿原酸预测值和真实值的相关系数图谱Fig.3 Correlation coefficient im age of p redicted values and true values of chlorogenic acid

图4 黄芩苷预测值和真实值的相关系数图谱Fig.4 Correlation coefficient image of predicted values and true values of baicalin

由图可知，预测值和真实值之间的线性相关十分显著，表明该模型可有效表征银黄口服液中绿原酸和黄芩苷含有量的模型预测值与真实值。

2.3 模型稳定性与预测效果评价

2.3.1 重复性试验 取同一样品溶液（批号131138）6份，在“1.5”项条件下测定，得到近红外扫描图，用模型预测其中绿原酸和黄芩苷的含有量。结果，两者平均含有量分别为7.476 mg/mL（ISD＝0.96%）和29.03 mg/mL（ISD＝2.0%），表明该模型重复性良好。

2.3.2 日间精密度试验 取同一样品溶液（批号131138）1份，在“1.5”项条件下，于0、24、48、72、96、120 h测定，得到近红外扫描图，用模型预测其中绿原酸和黄芩苷的含有量。结果，两者平均含有量分别为7.453 mg/mL（ISD＝1.9%）和28.87 mg/mL（ISD＝1.3%），表明在120 h内日间精密度良好。

2.3.3 模型预测效果的评价 为验证上述模型的预测效果，将相关性模型用于预测余下样本中绿原酸和黄芩苷的含有量。结果见表5和表6。

表5 绿原酸的预测值Tab.5 Predicted values of chlorogenic acid

表6 黄芩苷的预测值Tab.6 Predicted values of baicalin

其中，马氏距离是指预测光谱与建模光谱平均主成分特征向量之间的距离，与所有建模光谱平均主成分特征向量之间的距离的比值，值越小，说明预测的可靠性越好。以上两表中各样品的马氏距离均小于1，绿原酸和黄芩苷的ISD分别为2.1%和1.7%，说明预测结果十分可靠，所建立的银黄口服液相关性模型预测性能良好，可用于在线监测该药物工业化大生产的实时含有量。

3 讨论

本实验采用近红外光谱法测定银黄口服液中绿原酸和黄芩苷的含有量，并结合HPLC和偏最小二乘法建立其相关性模型。结果显示，该模型准确可靠，比HPLC法更快速、简便、环保、准确，可为中药制剂生产实时监测提供可靠方法。

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Determ ination of Yinhuang 0 ral Liquid by near-infrared spectroscopy and establishment of dependency model

ZHANG Ye-xia1， PAN Jin-huo1， CAI Bao-chang2，3， QIN Kun-ming3， LIU Xiao1，2， WANG Yerun1， YAN Guo-jun1*
（I.School of Pharmacy，NanJing University of ChineseMedicine，NanJing 2IOO23，China；2.Engineering Research Center of StateMinistry of Education for Standardization of Chinese Materia Medica Processing，NanJing University of Chinese Medicine，NanJing 2IOO23，China；3.NanJing Haichang Chinese Medicine Co.，Ltd.，NanJing 2IOO6I，China）

ABSTRACT：AIM To determine the contents of ch1orogenic acid and baica1in in Yinhuang Ora1Liquid（Lonicera Japonica and Scutellaria baicalensis）by near-infrared spectroscopy and to estab1ish a dependencymode1 for quantitative ana1ysis.METH0DS Based on the near-infrared spectroscopy data of thirty batches of Yinhuang Ora1 Liquid，the dependencymode1 for ch1orogenic acid and baic1in was estab1ished by HPLC and partia11east squares. RESULTS 9 401.6 -7 826 cm-1served the bestwaveband for the detection of both ch1orogenic acid and baica-1in，0.985 2 and 0.988 1 were for I2，0.002 96 and 0.018 were for root-mean-squares error of cross-va1idation （IMSECV），and 8.23 and 9.27 were for regression point disp1acement（IPD），respective1y.When thismode1 was used for the determination of these two constituents，the predicted Mash distance va1ues of both constituentsbook=566,ebook=100were 1ess than 1，whose re1ative errorswere 2.12% and 1.67%，respective1y.C0 NCLUSI0 N With good predictabi1ity，thismode1 can be app1ied to the rea1 timemonitoring and qua1ity contro1of Yinhuang Ora1Liquid.

*通信作者：严国俊（1980—），男，副教授，研究方向为中药新型给药系统及评价。Te1：13770598093，E-mai1：joun.yan@163.com

作者简介：张叶霞（1991—），女，硕士生，研究方向为新药剂型与开发。Te1：15805171380，E-mai1：15805171380@163.com

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81202922）；江苏省科技支撑计划工业项目（BE2012011）；江苏省自然科学基金青年基金项目（BK2012089）

收稿日期：2015-05-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.018

中图分类号：I927.2

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）03-0565-05