脑络通颗粒对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化血管重构的影响

严士海， 张建平， 王海丹， 高 峰， 朱长乐（.南京中医药大学附属医院科技处，江苏南京009；.浙江省奉化市人民医院药剂科，浙江奉化35500）



脑络通颗粒对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化血管重构的影响

严士海1， 张建平2， 王海丹1， 高 峰1， 朱长乐1
（1.南京中医药大学附属医院科技处，江苏南京210029；2.浙江省奉化市人民医院药剂科，浙江奉化315500）

摘要：目的 观察脑络通颗粒（制首乌、黄精、海藻等）对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型的影响。方法 高脂饲料饲养30只ApoE-/-小鼠10个月，随机分为模型组、脑络通组（6.67 g/kg）、辛伐他汀组（6.67 mg/kg），每组10只。给药后小鼠取血清，生化法检测血脂；取主动脉，Masson染色法观察血管胶原/面积比；Wetern b1ot检测基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）、基质金属蛋白酶抑制剂1 （TIMP1）、基质金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）的水平。结果 脑络通能调整血脂水平，使血管胶原/面积比增加（P＜0.01），明显降低MMP2、MMP9、MT1-MMP水平（P＜0.05），明显升高TIMP1、TIMP2水平（P＜0.05）。与辛伐他汀组相当。结论 脑络通具有改善血管重构的作用，其机制可能与降低MMP2、MMP9、MT1-MMP水平，增加TIMP1、TIMP2的表达有关。

关键词：脑络通颗粒；ApoE-/-小鼠；动脉粥样硬化；基质金属蛋白酶（MMP2、MMP9）；膜型基质金属蛋白酶1 （MT1-MMP）；基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP1、TIMP2）

KEY W 0RDS：Nao1uotong Granu1es；ApoE-/-mice；atherosc1erosis；MMP2 and MMP9；MT1-MMP；TIMP1 and TIMP2

动脉粥样硬化（atherosc1erosis，AS）是冠心病、脑中风的病理基础，严重威胁人类健康。大量研究发现，基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂参与了机体发生AS时的血管重构、斑块破裂等一系列病理生理过程［1］。最新研究发现MMPs在AS斑块内呈过度表达，通过降解细胞外基质（ECM）使血管斑块顶部变薄，导致斑块易破裂出血。脑络通颗粒是南京中医药大学附属医院院内制剂，由制首乌、黄精、海藻、水蛭、川芎组成，具有滋肾养肝、化痰消瘀等作用，临床研究显示其在降低AS患者血脂水平、改善血液流变学参数、治疗中风后遗症等方面有很大的价值［2］，但其对血管壁重构是否有作用值得研究。本实验通过观察脑络通对ApoE-/-小鼠AS模型血管胶原/血管面积比、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9 （MMP9）、膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）、基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）、基质金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）水平的影响，以期进一步探讨该药物在血管壁重构方面的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验用药 脑络通颗粒（制首乌30 g、黄精15 g、海藻10 g、水蛭6 g、川芎10 g），制法为取制首乌、黄精、海藻、川芎4味药水煮醇沉，水蛭水提，分别浓缩，加入糊精，流化床制粒，每1 g颗粒剂相当于生药3.5 g（南京中医药大学附属医院制剂部，批号20120220）；辛伐他汀片（杭州默沙东制药有限公司生产，批号120710）。

1.2 实验动物 ApoE-/-小鼠30只，SPF级，8周龄，体质量（20±2）g，雄性，由北京大学医学部实验动物科学部提供，实验动物许可证号SCXK（京）2011-0012。

1.3 实验饲料 高脂饲料（江苏协同医药生物工程有限公司，批号20120322）。

1.4 实验条件 小鼠均分笼饲养，按不同组别分别饲喂全价营养颗粒饲料及高脂饲料，自由饮水，室温（22±2）℃，湿度55%～65%，光照适度，通风洁净良好。

1.5 实验用仪器 FA1004型电子分析天平（上海精密科学仪器厂）；752分光光度计（上海分析仪器厂）；Western电泳仪（164-5051，美国Bio-Iad）；高速冷冻离心机（D-37520，美国Sorva11）；紫外光度仪（UV-2450，日本Shimadzu）；凝胶成像仪（Ge1Doc XI，美国Bio-Iad）。

1.6 实验用试剂 胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒，（日本第一化学药品株式会社，批号20130402）；全蛋白抽提试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号20130527）；Braford蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号201300118）；5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（南京凯基生物科技发展有限公司）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号20130309）；MMP2（美国Santa cruz，货号Sc-6838）；MMP9（美国Santa cruz，货号Sc-6840）；MT1-MMP（美国Santa cruz，货号Sc-30074）；TIMP1（美国Biowor1d，货号BS1697）；TIMP2（英国Abcam，货号ab1828）。

2 实验方法

2.1 实验分组 模型组，等量蒸馏水；辛伐他汀组，6.67 mg/kg；脑络通组，6.67 g生药/kg，按相当于人临床剂量的10倍选择此剂量。

2.2 模型与干预 ApoE-/-小鼠，分为模型组、辛伐他汀组、脑络通组，给予高脂饲料10个月，经病理学检测确认模型成功后，根据分组给药治疗2个月。末次给药1 h后，脱颈椎处死小鼠，取主动脉（接近心脏1 cm），分成两部分，一部分行Masson染色，另一部分予液氮保存，待检测。

2.3 血管Masson染色与评价 血管标本采用Masson染色法，用Image p1us 5.1图像分析软件测量主动脉根部胶原面积（CA），计算胶原/血管面积比（CA/CVA）。

2.4 TIMP1、TIMP2、MMP2、MMP9、MT1-MMP蛋白表达测定 采用Western b1ot法。提取血管蛋白，蛋白样品处理后进行SDS-PAGE，转膜，染色，封闭，一抗二抗孵育，加发光液，曝光。保存显示有目的条带的胶片，以β-Actin为内参照，应用图象分析仪对条带做扫描半定量。

2.5 数据统计 应用SPSS 15.0软件包处理分析数据，资料数据均用均数±标准差（±s）表示，数据先进行方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著意义，P＜0.01为差异有非常显著意义。

3 实验结果

3.1 脑络通对主动脉的影响 病理结果（图1，×200）显示，主动脉有斑块，血管壁出现沉积的脂质-泡沫细胞及针形的胆固醇结晶。

图1 主动脉内斑块病理图（×200）Fig.1 Pathologic figure of aortic p laque（×200）

3.2 脑络通对血脂的影响 脑络通血清TC、TG、LDL-C的量比模型组明显下降，具有显著性差异（P＜0.01）；脑络通与辛伐他汀组小鼠血清TC、TG、LDL-C也显著下降，存在显著性差异（P＜0.01）；辛伐他汀组与脑络通组的差异不显著（P＞0.05）。提示脑络通对升高的ApoE-/-小鼠血脂水平具有调节作用。见表1。

表1 3组小鼠血脂水平（mmol/L，±s）Tab.1 Lipid levels in three groups of m ice（mmol/L，±s）

表1 3组小鼠血脂水平（mmol/L，±s）Tab.1 Lipid levels in three groups of m ice（mmol/L，±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01

组别　动物数/只TC　TG　LDL-C模型组10　 28.93±2.62 1.92±0.28　 9.73±1.69脑络通组　10　 17.28±1.47**1.55±0.30**2.97±0.75**辛伐他汀组　10　 15.20±1.95**1.48±0.20**2.41±0.45**

3.3 脑络通对胶原/血管面积比的影响 模型组斑块的胶原含有量及占斑块的面积比值为12.68%。分别给予辛伐他汀、脑络通治疗后，ApoE-/-小鼠主动脉组织中胶原增加，与模型组相比，具有显著性差异（P＜0.01）。3组都出现脂质斑块，板块内有胶原生长（绿色染色部分），辛伐他汀、脑络通组胶原增多。具体结果见表2、图2。

3.4 脑络通对血管组织中MMP2、MMP9、MT1-MMP、TIMP1、TIMP2表达的影响 脑络通可以下调ApoE-/-小鼠血管中MMP2、MMP9、MT1-MMP的表达，同时升高TIMP1、TIMP2的表达，与模型组相比具有显著性差异（P＜0.05），与辛伐他汀组比较无显著性差异（P＞0.05）。结果见图3。

表2 3组小鼠胶原/血管面积比（%，±s，n＝6）Tab.2 Ratios of collagen to vascular area in three groups ofm ice（%，±s，n＝6）

表2 3组小鼠胶原/血管面积比（%，±s，n＝6）Tab.2 Ratios of collagen to vascular area in three groups ofm ice（%，±s，n＝6）

注：与模型组比较，**P＜0.01

组别　　胶原/血管面积比模型组12.68±3.72脑络通组　20.56±4.07**辛伐他汀组　17.88±4.35**

图2 3组小鼠主动脉M asson染色代表图（×100）Fig.2 Representative images of M asson staining aortic p laque in three groups ofm ice（×100）

4 讨论

图3 脑络通颗粒对MMP2、MMP9、MT1-MMP、TIMP1、TIMP2表达的影响（n＝3）Fig.3 Effects of Naoluotong Granules on MMP2，MMP9，MT1-MMP，TIMP1 and TIMP2 levels（n＝3）

近年来，载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠已成为研究AS发病机制的最重要的动物模型。高脂饲料能加速AS模型的形成。随着年龄的增加，ApoE-/-小鼠动脉斑块面积逐步增大，斑块内脂质、细胞外基质成分逐步增多，而胶原和平滑肌细胞逐步减少，其斑块具备易损斑块的特征［3］。所以，ApoE-/-小鼠是研究AS和不同阶段AS的理想模型。

血管胶原/血管面积比可以反应易损斑块的特征。本实验研究发现，在给予脑络通、辛伐他汀分别治疗后，相比模型组，脑络通组与辛伐他汀组血管胶原/血管面积比增加，提示其具有抑制易损斑块的作用。

MMP是一类Zn2＋依赖性内肽酶。在AS这一病理过程中，MMP2、MMP9降解细胞外基质，削弱斑块表面纤维帽成分，使其抵抗应力的作用减弱，使AS斑块易于发生破裂，继而发生血栓的形成和机化［4-5］。本实验研究发现，在分别给予脑络通、辛伐他汀分别治疗后，ApoE-/-小鼠主动脉组织中MMP2与MMP9的量均降低，提示脑络通可能通过抑制主动脉组织中MMP2与MMP9的表达，起到稳定斑块的作用，其抑制程度与辛伐他汀组相当。

MT1-MMP是比较特殊的一类MMPs，它的氨基末端含有一个跨膜结构域，使其锚定在细胞表面，其主要的生物学特征是能够结合并激活MMP-2。本实验研究发现，在分别给予脑络通、辛伐他汀治疗后，ApoE-/-小鼠主动脉组织中MT1-MMP的表达均降低，提示脑络通可以抑制ApoE-/-主动脉组织中MT1-MMP的表达。

MMPs的主要生理抑制剂是TIMPs，主要包括TIMP1、TIMP2。TIMPs能够抑制MMPs的活性，其中TIMP1主要抑制MMP-1、-3、-9，而TIMP2主要抑制MMP2。资料显示［6-7］，正常内皮细胞和平滑肌细胞有TIMPs和MMPs的表达，以共同维持细胞外基质合成与降解的平衡。本实验研究发现，在分别给予脑络通、辛伐他汀治疗后，ApoE-/-小鼠主动脉组织中TIMP1、TIMP2的量均升高。

脑络通颗粒由制首乌、黄精、海藻、水蛭、川芎组成［8-9］，以制首乌为君，其味甘涩，性温，具有补益精血，滋肾养肝之功效。何首乌提取物可以影响核因子κB（NF-κB）等炎性因子的表达，抑制动脉粥样硬化斑块的胶原纤维降解，从而稳定斑块，预防斑块的破裂［10］。此类患者常感阴伤兼有气耗，筋骨无力，故以黄精辅佐首乌为臣，取其味甘，性平，具养阴益气，滋肾填精之功，其提取物黄精多糖具有降脂与抗AS的作用［11］。此外，痰瘀久痹，化、消必有较长时日，峻猛破伐之品，自非所宜，选药在于既具消、化之功，能除脉中之痰瘀，又可久用而不伤正，故以海藻、水蛭、川芎为佐。其中，海藻咸寒，有软坚化痰之功，能祛经隧胶着之痰；水蛭味咸苦性平，具逐血破结软坚之效。小量常服，活血化瘀而不伤正，痰浊得化，瘀血得消，血脉自畅。海藻、水蛭、川芎都可通过减轻氧化损伤、抑制炎症反应等环节，起到抗AS的作用［12］。全方标本兼顾，消补兼施，补虚不忘泻实，祛邪不忘扶正，共奏滋肾养肝、化痰消瘀之效，且药性平和，药证合拍，宜于久服。

综上所述，与模型组比较，脑络通组血管胶原/血管面积比增大，同时MMP2、MMP9、MT1-MMP水平明显降低，TIMP1、TIMP2明显升高，提示脑络通对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠血管基质重构具有调节作用。

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Effect of Naoluotong Granules on atherosclerotic vascular remodeling in ApoE-/-m ice

YAN Shi-hai1， ZHANG Jian-ping2， WANG Hai-dan1， GAO Feng1， ZHU Chang-1e1

（I.Science and Technology Department，Hospital Affiliated to NanJing University of Traditional Chinese Medicine，NanJing 2IOO29，China；2.Pharmacy Department，ZheJiang Provincial Fenghua People’s Hospital，Fenghua 3I55OO，China）

ABSTRACT：AIM To observe the effect of Nao1uotong Granu1es（Polygonimultiflori Radi，Polygonati Rhizoma，Sargassum，etc.）on atherosc1erotic vascu1ar remode1ing in ApoE-/-mice.METH 0DS Thirty ApoE-/-mice were fed with high fat diet for ten months and then equa11y assigned to themode1group，Nao1uotong Granu1es group（6.67 g/kg）and Simvastatin group（6.67 mg/kg）.Aftermedication，mice serum was taken for detecting b1ood 1ipid by biochemica1method，the ratio of co11agen to vesse1 area co11ected from aortic wa11was detected by Masson staining.The 1eve1s of MMP2，MMP9，MT1-MMP，TIMP1 and TIMP2 were examined by Western b1ot. RESULTS Nao1uotong Granu1es corrected the b1ood 1ipid 1eve1，increased the ratio of co11agen to vesse1 area （P＜0.01），decreased the expressions of MMP2，MMP9 and MT1-MMP（P＜0.05），and increased the expressions of TIMP1 and TIMP2（P＜0.05）.This group was found to be equiva1ent to Simvastatin group.C0 NCLU-book=481,ebook=15SION Nao1uotong Granu1es can improve atherosc1erotic vascu1ar remode1ing by decreasing the expressions of MMP2，MMP9 and MT1-MMP and increasing the expressoions of TIMP1 and TIMP2.

作者简介：严士海（1978—），男，硕士，副主任中药师，研究方向为中药药理学。Te1：（025）86555797，E-mai1：973580966@qq.com

基金项目：国家自然科学基金（81302902）；江苏省自然科学基金（BK20151355）

收稿日期：2014-09-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.002

中图分类号：I285.5

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）03-0480-05