沉默结缔组织生长因子表达对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

崔小伟，陈丽琴，周钧，周莉，王淑珍，张晶

(天津市滨海新区大港医院,天津300270)



沉默结缔组织生长因子表达对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

崔小伟，陈丽琴，周钧，周莉，王淑珍，张晶

(天津市滨海新区大港医院,天津300270)

摘要：目的观察靶向沉默结缔组织生长因子(CTGF)表达对肝星状细胞(HSC)-T6增殖、凋亡的影响。方法 将HSC-T6细胞随机分为3组，A、B组分别转染CTGF siRNA及无义序列4～6 h，C组不转染；培养24 h，采用RT-PCR法检测CTGF mRNA，MTT法检测细胞增殖速度，Annexin V/PI 双染色法测算细胞凋亡率，Western blot法检测细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白。结果A组CTGF mRNA表达量(0.12±0.03)明显低于B组(0.87±0.07)和C组(0.85±0.09)，细胞增殖速度(0.21±0.05)明显慢于B组(0.38±0.04)和C组(0.39±0.05)，细胞凋亡率(37.5%±0.6%)高于B组(0.9%±0.3%)和C组(1.1%±0.2%)，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达量(29.2±0.8，26.4±2.7)均低于B组(66. 7±1.7，64.7±0.9)和C组(68.4±1.7，66.1±2.2)，P均<0.05。结论 靶向沉默CTGF基因可抑制HSC-T6细胞增殖，促进其凋亡，并显著减少Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成和分泌。

关键词：酒精性肝硬化；肝星状细胞；结缔组织生长因子；小干扰核糖核酸；细胞增殖；细胞凋亡

近年来，酒精性肝硬化病死率呈上升趋势[1～5]。目前，除早期预防以外，对酒精性肝硬化患者尚无有效治疗手段。以往研究发现过多的细胞外基质(ECM)沉积于肝脏就会形成肝纤维化，活化的肝星状细胞(HSC)是合成ECM的主要来源，在肝纤维化形成过程中起重要作用[6～8]，各种促肝纤维化细胞因子也可通过调控HSC参与肝纤维化的发生、发展。结缔组织生长因子(CTGF)是一种非结构性基质蛋白，能直接介导HSC的活化、合成和分泌ECM[9,10]。小干扰RNA(siRNA) 是基因靶向敲除的新型生物技术。2011年11月～2013年10月，我们通过构建CTGF特异性的siRNA并转染HSC-T6细胞，观察下调CTGF水平对HSC-T6细胞增殖和凋亡的影响。

1材料与方法

1.1材料HSC-T6细胞株购自上海肿瘤研究所；CTGF siRNA质粒由武汉晶赛生物技术有限公司合成，Lipofectamine 2000(美国Invitrogene公司)；抗CTGF、Ⅰ和Ⅲ型胶原抗体(美国Chemicon公司),辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；胎牛血清(杭州四季青公司)，改良Eagle培养基DMEM、青链霉素和胰蛋白酶(Gibco公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染将HSC-T6细胞置于含10%胎牛血清的DMEM中，于饱和湿度、37 ℃、5%CO2培养箱中孵箱。隔日换液，每3～4 d传代1次。取生长良好的HSC-T6细胞，用无血清DMEM清洗细胞2次，将细胞随机分为3组。A、B组分别采用Lipofectamine 2000转染CTGF siRNA及无义序列，C组不转染；于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4～6 h，加胎牛血清终止转染，继续培养24 h。

1.2.2细胞CTGF mRNA检测采用RT-PCR法。应用TRIzol试剂提取细胞总RNA，并进行逆转录反应。PCR条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30 次。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，以2-ΔΔCT法分析基因相对表达量。

1.2.3细胞增殖观察 采用MTT 法。将各组细胞接种于 96 孔板，1×104/孔，每组设3个复孔。加入培养液培养，于培养第1、2、3、4、5、6 、7天行MTT检测；在酶标仪上测定各孔波长570 nm时的光密度(OD)值，绘制细胞生长曲线，计算细胞增殖速度。细胞增殖速度=(第7天OD值-第1天OD值)/第1天OD值。

1.2.4细胞凋亡率测算 采用Annexin V/PI 双染色法。消化、收集各组细胞，PBS重悬，在流式细胞仪(FACS Caliber，USA)上检测。按照Annexin V/PI 染色试剂盒说明，加入固定破膜剂和 PI染液；室温避光反应 30 min后，在荧光显微镜下观察凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.2.5细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白检测 采用Western blot法。提取各组细胞总蛋白，以Bradford 法行蛋白定量；用8%分离胶电泳，冰浴下100 V转膜60 min。分别加抗Ⅰ型胶原(1∶1 000)和抗Ⅲ型胶原(1∶1 000)抗体，4 ℃下水平摇床孵育过夜。次日用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500)孵育1 h，以凝胶成像分析系统检测OD值，以Quantity One分析软件进行定量分析。以目的蛋白与β-actin的OD值比值作为目的蛋白表达量。

2结果

2.1各组细胞CTGF mRNA表达比较A组细胞CTGF mRNA表达量(0.12±0.03)明显低于B组(0.87±0.07)和C组(0.85±0.09)，P均<0.05。

2.2各组细胞增殖速度比较A组细胞增殖速度(0.21±0.05)明显慢于B组(0.38±0.04)和C组(0.39±0.05)，P均<0.05。

2.3各组细胞凋亡率比较A组细胞凋亡率(37.5%±0.6%)高于B组(0.9%±0.3%)和C组(1.1%±0.2%)，P均<0.01。

2.4各组细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达比较A组细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达量(29.2±0.8，26.4±2.7)均低于B组(66.7±1.7，64.7±0.9)和C组(68.4±1.7，66.1±2.2)，P均<0.01。

3讨论

CTGF是在人类脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的，因能刺激纤维母细胞DNA合成并促进趋化作用而得名。研究表明，CTGF是各种慢性肝病发展到肝硬化过程中的刺激因子，同时还涉及多个环节[11,12]。CTGF表达上调被认为是HSC活化的中心通路，阻断CTGF基因表达具有减少ECM合成及抑制肝纤维化进展的效果。文献报道，在慢性肝病患者及实验性肝纤维化大鼠中，肝组织CTGF基因表达水平均明显增高，并与肝纤维化病理学分级呈正相关，提示CTGF可能在肝纤维化发生、发展中起重要作[3]。目前肝纤维化诊断的金标准仍然是肝组织活检，但因是有创检查具有一定的风险。有研究表明，肝纤维化患者血清CTGF水平增高，而肝硬化患者反而升高不明显[13]。因此，CTGF作为一项无创的检查，在肝纤维化的检测和治疗上应用前景广泛。

近年来研究发现，siRNA能高效特异性地阻断相应基因的表达，促进RNA降解，在细胞内发挥基因敲除的作用[14]。化学合成的siRNA 可在哺乳动物体内外介导同源基因的沉默，从而发挥治疗作用。本研究结果发现，CTGF siRNA序列可降低HSC-T6细胞CTGF表达，抑制细胞增殖活性，促进细胞凋亡，Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达下降，表明沉默CTGF基因对于酒精性肝纤维化的发展可能有一定的抑制作用。我们将构建大鼠酒精性肝硬化模型，对进展期肝纤维化行siRNA干预治疗，进一步评价CTGF在酒精性肝硬化中的治疗作用。

参考文献：

[1] Wang X, Lin SX, Tao J, et al. Study of liver cirrhosis over ten consecutive years in Southern China[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(37):13546-13555.

[2] 王晓霞,邹正升,李保森,等.2002至2011年中国北方地区住院肝硬化患者病因构成及变化趋势分析[J].实用肝脏病杂志,2014,17(2):154-158.

[3] 赵箐.酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的机制研究进展[J]．国外医学:药学分册,2006,33(3)：198-203．

[4] 王小莲,吴江锋.酒精性肝纤维化发生机制的研究进展[J].重庆医学,2013,42(4)：464-466.

[5] Penny SM. Alcoholic liver disease[J]. Radiol Technol,2013,84(6):577-579.

[6] Dwyer BJ, Olynyk JK, Ramm GA, et al. TWEAK and LTβ signaling during chronic liver disease[J]. Front Immunol, 2014,13(5):39.

[7] Abhilash PA, Harikrishnan R, Indira M. Ascorbic acid suppresses endotoxemia and NF-κB signaling cascade in alcoholic liver fibrosis in guinea pigs:a mechanistic approach[J]. Toxi Appl Pharmacol, 2014,274(2):215-224.

[8] Colak Y, Senates E, Coskunpinar E, et al. Concentrations of connective tissue growth factor in patients with nonalcoholic fatty liver disease: association with liver fibrosis[J]. Dis Markers, 2012,33(2):77-83.

[9] Chakraborty D, Sunil HV, Mittal BR, et al. Role of Tc99m sulfur colloid scintigraphy in differentiating non-cirrhotic portal fibrosis from cirrhosis liver[J]. Indian J Nucl Med, 2010,25(4):139-142.

[10] Wallace K, Burr AD, Wright MC. Liver fibrosis[J].Biochem J, 2008,411(1):1-18.

[11] Violi F, Basili S, Raparelli V, et al. Patients with liver cirrhosissuffer from primary haemostatic defects? Fact or fiction[J]. Hepatology, 2011,55(6):1415-1427.

[12] 汪明明,崔速南,李新立,等.结缔组织生长因子在慢性乙型肝炎和肝硬化组织中的表达及意义[J].山东医药,2005,45(29):17-18.

[13] Gressner AM, Yagmur E, Lahme B, et al. Connective tissue growth factor in serum as a new candidate test for assessment of hepatic fibrosis[J]. Clin Chem, 2006,52(9):1815-1817．

[14] Chen T, Deng C. Inhibitory effect of siRNA targeting survivin in gastric cancer MGC-803 cells[J]. Int Immunopharmacol, 2008,8(7):1006-1011.

(收稿日期：2015-09-02)

中图分类号：R575

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0027-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.010

基金项目：天津市滨海新区卫生局医药卫生科技资助项目(2011BHKY020)。