二烯丙基二硫对非小细胞肺癌细胞miR-200b表达的影响及意义

罗卫民，罗湘玉，郭家龙，林称意，刘越峰

(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北十堰442000)

二烯丙基二硫对非小细胞肺癌细胞miR-200b表达的影响及意义

罗卫民，罗湘玉，郭家龙，林称意，刘越峰

(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北十堰442000)

目的 探讨二烯丙基二硫(DADS)对人非小细胞肺癌A549(A549细胞)miR-200b表达的影响及意义。方法 常规培养A549细胞、人支气管上皮16HBE细胞，连续培养48 h时采用RT-PCR法检测miR-200b相对表达量；将A549细胞分别与终浓度为0、25、50、100、200、400 μmol/L的DADS共培养，连续培养48 h时采用RT-PCR法检测miR-200b相对表达量。将常规培养的A549细胞随机分为五组，scramble组转染miR-200b无关序列，miR-200b组转染miR-200b模拟物，空白组仅加培养液常规培养，DADS组加入200 μmol/L DADS处理，DADS+miR-200b组转染miR-200b 模拟物的同时加入200 μmol/L DADS处理，各组均连续培养48 h时，采用MTT法检测细胞增殖情况(OD值)。结果 16HBE细胞miR-200b相对表达量为1.364±0.031，高于A549细胞的0.673±0.023(P<0.05)；0、25、50、100、200、400 μmol/L DADS处理A549细胞48 h时miR-200b相对表达量分别为0.673±0.023、0.752±0.019、0.805±0.011、1.041±0.049、1.176±0.046、1.342±0.051，各浓度间比较P均<0.05。scramble组、miR-200b组、空白组、DADS组、DADS+miR-200b组OD值分别为0.740±0.027、0.552±0.024、0.735±0.021、0.561±0.027、0.462±0.026，miR-200b组、DADS组、DADS+miR-200b组OD值均低于scramble组及空白组，DADS+miR-200b 组均低于DADS组及miR-200b组，组间比较P均<0.05。结论 DADS能够上调A549细胞miR-200b表达，进而抑制细胞增殖，发挥抗肿瘤作用。

非小细胞肺癌；二烯丙基二硫；miR-200b

二烯丙基二硫(DADS)是从大蒜中提取的天然有机硫化物，可抑制多种肿瘤的发生、发展，包括鼻咽癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等[1～5]，其作用机制主要为抑制DNA加合物形成，阻滞细胞周期演进，诱导肿瘤细胞分化与凋亡，抑制肿瘤血管形成与侵袭等[6]。研究显示，miR-200b在多种肿瘤中表达下调，发挥抑癌基因样作用[7,8]。但是，miR-200b与肺癌发生、发展的关系，以及DADA对其表达的影响尚不完全明确。2015年3～8月，本研究观察了DADS对人非小细胞肺癌A549细胞miR-200b表达的影响，现分析结果并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 人非小细胞肺癌A549细胞株和人支气管上皮16HBE细胞由中山大学肿瘤研究所惠赠；Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司；MTT购于美国Sigma公司；miR-200b模拟物、scramble无关序列均由Ambion公司设计合成；RNA抽提试剂盒购于美国Ambion公司；DADS购于Fluka公司。

1.2 细胞培养及miR-200b表达检测 A549细胞及16HBE细胞分别用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48 h，细胞生长至融合80%左右时，采用RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL，包括MiR-PCR primers(5 mmol/L)0.4 μL、miRNA RT product 2.0 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、2×SYBR Mix 10 μL、灭菌蒸馏水7.4 μL。反应条件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 12 s、62 ℃ 35 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算miR-200b相对表达量。

1.3 DADS对A549细胞miR-200b表达影响的观察 取1.2常规培养48 h、生长至融合度80%左右的A549细胞置于培养瓶中，分别将终浓度为0、25、50、100、200、400 μmol/L的DADS加至培养瓶中，继续培养48 h，采用1.2方法检测miR-200b相对表达量。

1.4 DADS对A549细胞增殖影响的观察 常规培养A549细胞，当细胞生长至融合度80%左右时将细胞随机分为五组，scramble组转染scramble(miR-200b无关序列)，miR-200b组转染miR-200b 模拟物，空白组仅加培养液常规培养，DADS组加入200 μmol/L(前期将0、25、50、100、200、400 μmol/L的DADS处理A549细胞48 h，采用MTT法检测各组吸光度值，并计算各组细胞抑制率，结果显示，DADS浓度为200 μmol/L组细胞的抑制率为50%，即DADS的半数抑制浓度为200 μmol/L，因此后续实验选择200 μmol/L浓度)DADS处理，DADS+miR-200b组转染miR-200b 模拟物的同时加入200 μmol/L DADS处理。上述五组均在连续培养48 h时采用MTT法观察细胞增殖情况(测定570 nm波长处吸光度值，即OD值)。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1A549细胞、16HBE细胞miR-200b表达比较 常规培养48h时16HBE细胞miR-200b相对表达量为1.364±0.031，高于A549细胞的0.673±0.023(P<0.05)。0、25、50、100、200、400μmol/LDADS处理A549细胞48h时miR-200b相对表达量分别为0.673±0.023、0.752±0.019、0.805±0.011、1.041±0.049、1.176±0.046、1.342±0.051，miR-200b相对表达量呈逐渐增加趋势(P均<0.05)。

2.2 各组细胞增殖情况比较scramble组、miR-200b组、空白组、DADS组、DADS+miR-200b组处理48h时OD值分别为0.740±0.027、0.552±0.024、0.735±0.021、0.561±0.027、0.462±0.026，miR-200b组、DADS组、DADS+miR-200b组OD值均低于scramble组及空白组，DADS+miR-200b组均低于DADS组及miR-200b组，组间比较P均<0.05。

3 讨论

手术切除是肺癌首选的治疗方法，但由于缺乏有效的早期诊断方法，约75%的患者确诊时已失去手术机会[9]。非小细胞肺癌占肺癌的75%～80%[10]，易发生远处转移，5年生存率约10%[9]。miRNA是一类高度保守，长度为22个核苷酸的小分子RNA，在真核生物中广泛表达。miRNA通过与靶基因mRNA3′UTR结合，在转录后水平调控基因表达，参与细胞增殖、凋亡、分化、衰老等多种生理过程。研究显示，miR-200b在多种上皮性肿瘤中可以调控细胞的周期演进与增殖、上皮间质转化(EMT)及细胞耐药等[7]。在宫颈癌细胞中，miR-200b通过直接下调RND3表达，促进其下游细胞周期D1蛋白表达，进而促使宫颈癌细胞向S期演进[11]。miR-200b通过直接靶向E-钙黏蛋白(E-cadherin)抑制转录因子ZEB1、ZEB2表达，使E-cadherin表达上调，从而抑制EMT[12]。miR-200b通过靶向环腺苷酸反应元件结合蛋白1(CREB1)抑制胶质瘤细胞增殖[13]。在乳腺癌细胞中，miR-200b通过直接靶向调控转录因子Sp1抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡[14]。本研究发现，A549细胞miR-200b表达明显低于16HBE细胞，提示miR-200b表达下调可能参与肺癌的发生。

越来越多的研究表明，DADS在多种肿瘤中通过不同途径抑制肿瘤其的增殖与转移，并诱导细胞分化与凋亡。Tang等[4]研究表明，DADS可抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，调控Wnt信号通路进而上调胃癌组织miR-200b表达可能是其作用机制。Xiao等[15]研究证实，DADS通过上调miR-34a抑制SRC/Ras信号通路，从而抑制人乳腺癌细胞的增殖与转移。本研究显示，随着DADS剂量增加，miR-200b在肺癌细胞中的表达逐渐上调，且呈剂量依赖性关系。证实DADS可上调A549细胞miR-200b表达。

为进一步明确miR-200b在非小细胞肺癌中的作用及DADS对其表达的影响，本研究将miR-200b模拟物转染染入A549细胞，使其外源高表达miR-200b，并将200μmol/LDADS与miR-200b共同作用于A549细胞。MTT结果显示，外源高表达miR-200b能明显抑制A549细胞的增殖能力，将DADS与miR-200b共同作用后，细胞增殖抑制作用更为明显；上述结果提示，miR-200b不仅能抑制肺癌细胞的增殖，还能增强DADS的抑瘤作用，但其作用机制尚未明确。

综上所述，DADS能够上调肺癌A549细胞miR-200b表达，进而抑制细胞增殖，发挥抗肿瘤作用。

[1]ZhangYW,WenJ,XiaoJB,etal.InductionofapoptosisandtransientincreaseofphosphorylatedMAPKsbydiallyldisulfidetreatmentinhumannasopharyngealcarcinomaCNE2cells[J].ArchPharmRes, 2006,29(12):1125-1131.

[2]XiaoD,PintoJT,GundersenGG,etal.Effectsofaseriesoforganosulfurcompoundsonmitoticarrestandinductionofapoptosisincoloncancercells[J].MolCancerTher, 2005,4(9):1388-1398.

[3]AltonsyMO,HabibTN,AndrewsSC.Diallyldisulfide-inducedapoptosisinabreast-cancercellline(MCF-7)maybecausedbyinhibitionofhistonedeacety-lation[J].NutrCancer, 2012,64(8):1251-1260.

[4]TangH,KongY,GuoJ,etal.DiallyldisulfidesuppressesproliferationandinducesapoptosisinhumangastriccancerthroughWnt-1signalingpathwaybyup-regulationofmiR-200bandmiR-22 [J].CancerLett, 2013,340(1):72-81.

[5]NagarajNS,AnilakumarKR,SinghOV.Diallyldisulfidecausescaspase-dependentapoptosisinhumancancercellsthroughaBax-triggeredmitochondrialpathway[J].JNutrBiochem, 2010,21(5):405-412.

[6]TsuburaA,LaiYC,KuwataM,etal.Anticancereffectsofgarlicandgarlic-derivedcompoundsforbreastcancercontrol[J].AnticancerAgentsMedChem, 2011,11(3):249-253.

[7]FengX,WangZ,FillmoreR,etal.MiR-200,anewstarmiRNAinhumancancer[J].CancerLett, 2014,344(2):166-173.

[8]SunL,YaoY,LiuB,etal.MiR-200bandmiR-15bregulatechemotherapy-inducedepithelial-mesenchymaltransitioninhumantonguecancercellsbytargetingBMI1[J].Oncogene, 2012,31(4):432-445.

[9]SherT,DyGK,AdjeiAA.Smallcelllungcancer[J].MayoClinProc, 2008,83(3): 355-367.

[10]LiuX,ZhangH,YuX,etal.ThecorrelationofexpressionofVEGFandEGFRwithSUVof(18)FDG-PET-CTinnon-smallcelllungcancer[J].ContempOncol(Pozn), 2014,18(5):334-339.

[11]XiaW,LiJ,ChenL,etal.MicroRNA-200bregulatescyclinD1expressionandpromotesS-phaseentrybytargetingRND3inHeLacells[J].MolCellBiochem, 2010,344(1-2):261-266.

[12]BrackenCP,GregoryPA,KolesnikoffN,etal.AdoublenegativefeedbackloopbetweenZEB1-SIP1andthemicroRNA-200familyregulatesepithelial-mesenchymaltransition[J].CancerRes, 2008,68(19):7846-7854.

[13]PengB,HuS,JunQ,etal.MicroRNA-200btargetsCREB1andsuppressescellgrowthinhumanmalignantglioma[J].MolCellBiochem, 2013,379(1-2):51-58.

[14]YaoY,HuJ,ShenZ,etal.MiR-200bexpressioninbreastcancer:aprognosticmarkerandactoncellproliferationandapoptosisbytargetingSp1[J].JCellMolMed, 2015,19(4):760-769.

[15]XiaoX,ChenB,LiuX,etal.DiallyldisulfidesuppressesSRC/Ras/ERKsignaling-mediatedproliferationandmetastasisinhumanbreastcancerbyup-regulatingmiR-34a[J].PLoSOne, 2014,9(11):e112720.

湖北省教育厅科学研究计划指导性项目(B2015477)。

刘越峰(E-mail: yuefengliu15@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.010

R734.2

A

1002-266X(2016)44-0033-03

2015-12-06)