慢性乙型肝炎后肝硬化证候的生物物质基础研究进展＊

刘亚敏，石玉琳，陈 健，汤琛琛，苏式兵，陈启龙

（上海中医药大学中医复杂系统研究中心 上海 201203）

慢性乙型肝炎后肝硬化证候的生物物质基础研究进展＊

刘亚敏，石玉琳，陈 健，汤琛琛，苏式兵，陈启龙＊＊

（上海中医药大学中医复杂系统研究中心 上海 201203）

慢性乙型肝炎（乙肝）后肝硬化是慢性乙型肝炎进展至终末期的常见表现，临床治疗一直收效甚微。中医辨证治疗乙肝后肝硬化具有独特作用。近年来，中医药在临床辨证及对证治疗慢性病已经有了大量的探索，但复杂的“病”、“证”关系依然制约了中医药治疗乙肝后肝硬化的发展。本文从乙肝后肝硬化病证机制出发，分别从基因、蛋白、代谢及表观遗传学水平阐述了乙肝后肝硬化“病”的分子机制及“证”的生物物质基础。并展望了基于病证结合的中医精准医疗在乙肝后肝硬化个性化治疗上的应用前景，以期为乙肝后肝硬化中医精确治疗的发展提供参考。

中医药 乙肝后肝硬化 病与证 生物物质基础

慢性乙型肝炎（慢乙肝）后肝硬化（Hepatitis B-Caused Cirrhosis，HBC）是由乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）引起的慢性、进行性、弥漫性肝纤维化以及假小叶的形成为特点的慢性疾病。中国的HBV感染及慢乙肝患者众多，其中有超过30%的患者在未来15年内会发展成肝硬化[1]。在乙肝肝硬化的失代偿期，会出现腹水、门静脉高压及肝性脑病、上消化道出血等并发症，严重危害患者的生命安全，每年死亡人数可高达100万[2]。由于乙肝后肝硬化的分子机制十分复杂，临床治疗依然面临诸多困难，而中医辨证治疗认为是乙肝后肝硬化治疗的一种独特方法。一般而言，中医治疗会根据患者体质、发病原因、具体表象以及病程进展等进行综合判断、辨证施治[3，4]。然而，由于现今符合中医药特点的疗效评价方法及其体系还不够完善，导致中医治疗乙肝后肝硬化的临床效价难以体现[5]，究其原因是因为乙肝后肝硬化在中医证型间的动态变化[6，7]及病证关系机制还有待深入研究。

1 病、证的一般内涵

病与证是相互联系的，但二者又具有不同的内涵。病以病理学内容为核心，具有一定发展规律且表现出若干特定症状的演变过程；证以病机为核心，是对疾病所处一定阶段的病因、性质、位置等所做的概括[8]。辨病即是从微观角度出发，借助实验手段来认识疾病的全过程，探求致病因子作用于不同机体表现出来的共同病理变化[9]；而辨证是从宏观角度，注重根据病情某一发展阶段的病理特点而做出阶段性的判断[10]。此外，疾病在不同时点、阶段可表现为不同的证候，体现出一定的证候演变[11]。因此，疾病是决定证候的内在稳定的因素，证候是疾病的外在综合表现[12]。从疾病发展时间上看，病包含多个证，体现了其动态变化的过程。在空间上，疾病发生又可表现为一证包含多病的情况[13]。病与证具有一定的时空效应，反映出病、证在时间与空间上复杂的交叉网络关系。

2 乙肝后肝硬化的“病”与“证”

目前，乙肝后肝硬化“病”、“证”的内在关联研究依然面临诸多困难。主要体现在微观的生物学指标与宏观的证候表型之间关系错综复杂，缺乏一个阐释证候内在整体性的研究方法[14]。因此，乙肝后肝硬化“病”的分子机制及“证”的分型与演化就成为系统阐述乙肝后肝硬化中医病证关系机制的重要切入口。

2.1 乙肝后肝硬化“病”的分子机制

2.1.1 基因水平

在乙肝后肝硬化“病”的动态变化中，发现CASP1、TGF-β1、IFI30、HLA-DMA、PAG1可能是慢乙肝-肝硬化过程的重要分子标志物[15]。Liu N等[16]证实，HBV可以通过下调miR-15a的表达导致SMAD7的水平上升，而SMAD7的高表达又会抑制TGF-β1引起的细胞凋亡，促发肝脏纤维化甚至肿瘤的发生。Luo S M等[17]通过对比不同基因的表达量发现，IGF1和IGFBP3基因表达失衡可能是影响乙肝后肝硬化预后的重要因素。在肝硬化病人血清及外周血单核细胞中，IL17基因的表达水平升高，提示IL17不仅是导致炎症发生的重要基因，还可能是肝硬化恶化的重要因素之一[18]。Cheong J Y等[19]发现，miR-604的rs2368392 CC基因型多见于慢乙肝、肝硬化及肝癌患者中，有趣的是，miR-604的T等位基因虽然是慢乙肝的易感基因，但却是阻止慢乙肝向肝硬化、肝癌发展的保护型基因。郭琳琅[20]发现，凋亡基因BAX和FAS过表达可能参与乙肝病毒致肝细胞损伤过程，通过引起感染细胞的凋亡而导致肝组织损伤。同时，在NF-κB和TGF-β信号通路中，上调miR-29的表达能够抑制肝星状细胞中胶原的分泌，从而延缓肝炎患者进展成肝硬化[21，22]。而miR-222/miR-221的上调表达可激活肝星状细胞胶原的分泌[23]，加速了患者肝纤维化及肝硬化的进程。此外，miR-181b、miR-214-5p、miR-133a、miR-199等也认为可能是乙肝后肝硬化发展过程中的生物标志物[24]，其具体作用机制还有待于进一步探索。

2.1.2 蛋白质水平

研究证明，慢性肝病患者持续的HBV复制和表达可触发内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）[25]，而ERS可以上调MANF基因的表达及其编码蛋白的分泌。潘高峰等[26]对不同炎症和纤维化分级的肝脏穿刺组织进行ITRAQ蛋白质组学研究，发现MANF蛋白随着炎症和纤维化的加重而表达逐步增加。张超等[27]运用免疫组化法检测GRIM-19蛋白在不同组织中的表达水平，发现该蛋白在乙肝后肝硬化组织中的表达水平明显高于肝癌组织、癌旁组织以及正常肝组织。之前也有文献报道GRIM-19在一些癌组织中的表达显著降低或缺失，这可能是肝细胞发生癌变后启动了抗凋亡因子抑制GRIM-19表达[28，29]。因此，GRIM-19在肝硬化组织表达量一旦降低，则可能是肝细胞发生癌变的一个重要判断指标。卢小玲等[30]发现DNA损伤修复基因所编码的ERCC1蛋白会随着HBV-DNA的复制活跃而降低，并且其表达是随着乙肝患者的炎症程度及纤维化程度的加重而呈现出一种先升高后降低的趋势，提示ERCC1蛋白与慢乙肝和肝硬化的演变可能存在一定关系。此外，作为TLR3信号通路中重要的衔接蛋白TRIF常常会被感染的HBV所劫持而发展为免疫逃逸[31]。换而言之，通过人为上调肝细胞内TRIF蛋白的表达，促进了NF-κB、ISRE和IFN-β基因启动子的活化，诱导了具有抗病毒作用的炎症因子、ISGs和IFN-β的表达，有助于肝细胞内抗病毒状态的建立。

2.1.3 代谢水平

机体内代谢物是基因表达的最终产物，在代谢酶的作用下，其水平变化会受到机体内、外环境等多种因素的综合影响。由于肝脏是体内最重要的代谢器官，一旦肝脏受到损害，那么机体的最终代谢产物必将会发生变化[32]。陆强等[33]利用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）对肝癌、肝硬化患者和健康人血清中的代谢物分别进行检测，发现肝硬化、肝癌患者的血清中乙酰乙酸的含量降低，显示肝细胞中脂肪酸的分解代谢可能被抑制。进一步研究发现，抗氧化物质牛磺酸在肝硬化患者血清中含量增加，在肝癌患者的血清中却没有改变，表明肝硬化患者的肝细胞还可以通过增加合成牛磺酸来抵制自由基的危害，但肝细胞癌变后会导致肝脏内环境稳态遭受严重破坏，丧失了自我保护功能。与代偿期相比，肝硬化失代偿期患者血清中极低密度脂蛋白（Very Low-Density Lipoprotein，VLDL）和低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein，LDL）的水平降低[34]，可能是由于肝组织脂质合成的能力降低所导致。此外，由于肝脏同时还是人体内葡萄糖代谢的重要场所，许多肝硬化患者的空腹血糖高于健康人群，但又明显低于糖尿病患者，且其C肽及胰岛素水平比健康人群及糖尿病患者都高，说明肝硬化患者很可能存在胰岛素抵抗[35，36]。

2.1.4 表观遗传学水平

表观遗传学研究显示DNA甲基化状态可能为进一步明确慢性肝病发病机制提供线索[37]。Mann J等[38]首次发现了DNA甲基化在肝星状细胞激活过程中的作用。该研究用去甲基化药物处理肝星状细胞后，发现PPARγ及核转录因子kappa B的表达上调，从而可抑制肝星状细胞向肌成纤维细胞样细胞转化，延缓肝硬化的进程。Zhang Y等[39]也通过体外实验证实，CpG岛的甲基化可以显著减少cccDNA的转录及随后核心病毒DNA的复制；并且在基因P16启动子甲基化阳性的肝癌、肝硬化和慢性肝炎样本中没有发现P16蛋白的表达[40]。在外周血单核细胞中，XPO4基因的甲基化状态往往是一种非入侵的生物标志物，可用来预测乙型肝炎病毒感染的进程。进一步研究发现，XPO4 mRNA在乙肝及其肝硬化患者中的表达明显低于正常对照组，而XPO4启动子的甲基化率在肝癌患者中较正常组则高出很多[41]。肿瘤抑制基因CDO1，通常会在发生癌变时被其启动子的甲基化作用所沉默，导致表达下降，Yang等[42]分别选取了慢乙肝、肝硬化、肝癌及健康人群的血清进行检测发现，CDO1启动子甲基化作用肝硬化及肝癌患者中是明显高于正常对照组的，且在疾病的晚期，其甲基化也显著高于疾病早期。

2.2 乙肝后肝硬化“证”的分型与演化

2.2.1 中医证候分型

在乙肝后肝硬化中医证型分类研究中，李毅等[43]应用系统聚类方法对276例乙肝后肝硬化患者的症状、体征进行研究，认为HBC基本中医证型分为7类：湿热内蕴证、肝肾阴虚证、肝郁脾虚证、脾虚湿盛证、脾肾阳虚证、血瘀证、气（阳）虚证。同时，李毅等[44]还运用卡方检验方法对近30年来国内公开报道的肝硬化辨证分型文献数据进行比较，所得结论也与应用系统聚类方法获得的结果十分接近。来丽群等[45]发现TGF-β1、肝纤维化指标及肝功能分级与中医辨证分型密切相关，并认为TGF-β1、肝纤维化指标可以作为HBC的中医辨证中证型的量化指标。龚向京等[46]发现凋亡相关蛋白TFAR19的表达水平与HBC临床证候分型密切相关。乙肝后肝硬化患者血清TFAR19的表达水平从实证到虚证过程中呈现由高到低的趋势，且在偏实、虚实夹杂、偏虚的不同证型之间差别具有统计学意义，但TFAR19表达在瘀血内结证型的不同严重程度患者之间无显著差异，提示该阶段有可能是乙肝后肝硬化治疗的重要节点。杨新莉等[47，48]对中医体质类型与乙肝后肝硬化预后相关性进行研究发现，阴虚质和湿热质是乙肝后肝硬化患者的主要体质类型，其中阴虚质病情最重，预后最差。

2.2.2 中医证候演化

辨证论治是中医诊治乙肝后肝硬化的主要特色。临床上乙肝后肝硬化的变证、并证繁多，证型复杂。《内经》曰：“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”。机体发病，多是由于“两虚相得，外内合邪”。外邪侵袭人体，必然引起体内邪正交争，而正邪的胜负变化[49]，最终会导致如实证、虚证等不同证候间的动态演变。有研究表明，通过中医的辨证治疗，可有效降低慢乙肝患者肝硬化的发生率或是延长其发展成为肝硬化的病程时间[50]。因此，通过辨证分析乙肝后肝硬化的病证关系，有利于对不同“证”的患者设计个体化的“病”的治疗方式。

随着乙肝后肝硬化患者病情进展，机体的免疫状态发生改变，中医证型也随之发生动态变化[51]，早期由于湿热疫毒侵犯肝胆、肝失疏泄、弥漫三焦，表现出肝胆湿热证；中期邪毒留恋，困阻脾胃中焦，出现脾胃湿热证；后期则因湿热久羁，郁而化热，气血不足，可见肝肾阴虚证。单纯虚证或单纯实证减少，虚实夹杂证增多[52]，表明乙肝后肝硬化的证候在“病”的发展过程中会随时间、空间的推移发生动态演化，显示了乙肝后肝硬化的复杂多变的病证关系。此外，乙肝后肝硬化患者体内HBV病毒复制也与中医证型的演变一定相关性，HBV-DNA在湿热蕴结证中复制最为活跃，之后随着证型在“由实转虚”的演化过程中，HBV复制逐渐趋于平缓，并在脾虚湿盛证及肝气郁结证中复制量最低[53]。这种HBV-DNA复制的差异不仅反映了乙肝后肝硬化证候的演变趋势，也为其辨证治疗提供了依据。

3 乙肝后肝硬化“证”的物质基础

中医病证在分子水平的物质基础可能是由相关的基因群或蛋白群体表达异常及特异代谢组分等共同形成[54]，这些分子的变化及其分子间的相互关系是研究中医病证分子机制的前提。因此，证候的生物物质基础研究就成为系统阐述乙肝后肝硬化“病”、“证”分子机制的基础。

3.1 基于基因组学研究的证候物质基础

基因表达谱研究显示，乙肝后肝硬化实证主要涉及脂质代谢调节、免疫与炎症反应及氨基酸代谢，虚证主要涉及过氧化物酶活性、干细胞维持等功能，并参与色氨酸代谢、细胞周期磷酸化调节等信号通路[55]。在对慢乙肝及乙肝后肝硬化“同病异证”、“异病同证”分子机制研究中发现[55]，细胞膜G蛋白受体信号通路相关基因在慢乙肝两种证型均表达下调，但在乙肝后肝硬化两种证型中则显示既有下调又有上调的状态。进一步对在慢乙肝及乙肝后肝硬化中共表达基因调控网络研究发现，共表达基因与两种病的肝胆湿热证均呈低相关，而与肝郁脾虚证均呈高相关，显示这些基因可能作为证候判别的重要生物物质基础[56]。在探讨乙肝后肝硬化中医证候分类与基因表达之间关联时发现，湿热蕴结证和肝郁脾虚证间的基因网络表达模式差异较大[15]。此外，姜在来等[57]通过对慢性乙型肝炎后肝硬化患者中白细胞介素10（Interleukin-10，IL-10）基因单核苷酸多态性的检测，发现乙肝后肝硬化患者的脾虚湿盛证与IL-10基因819位点C等位基因相关，而其TT基因型则可能是肝硬化患者形成肝气郁结证的主要原因。而在乙肝后肝硬化肝气郁结证患者中，与人体情绪调节相关的GNB3基因C825T位点的CC基因型、C等位基因被认为可能是该证候的保护基因，而T等位基因可能是其易感基因[58]。

3.2 基于蛋白质组学研究的证候物质基础

利用蛋白组技术，周迪等[59]对103例肝硬化患者、29例健康人群及29例慢乙肝患者的血清标本进行检测，发现了典型肝硬化中医证候群血清蛋白质组的差异，并由此建立肝硬化各中医证候血清蛋白质诊断模型。Song Y N等[60]运用SELDI-TOF-MS技术对乙肝后肝硬化3种证型的血清蛋白进行检测，发现肝硬化患者肝胆湿热证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证的血清蛋白表达谱具有特征性差异峰，且证候之间有明显分离的趋势。安海燕等[61]对乙肝后肝硬化的肝气郁结证、肝肾阴虚证患者的血清蛋白组进行分析，发现相关差异表达蛋白主要涉及机体代谢、免疫、凝血、内分泌以及肿瘤细胞增殖代谢等多个方面。

3.3 基于代谢组学研究的证候物质基础

代谢组学一直是证候研究的重要方法之一，郭孜等[62]等对乙肝后肝硬化证候的尿代谢组学研究发现，不同证型的肝硬化患者的尿代谢物均与健康人群存在较大差异，这些差异代谢物大多与能量代谢和氨基酸代谢等通路密切相关，其中在湿热蕴结证与肝肾阴虚证之间存在支链氨基酸的差异，显示肝硬化患者不同证候间存在不同的尿代谢模式。杨永霞等[63]利用核磁共振技术对乙肝后肝硬化患者血清中代谢产物进行检测，与对照组相比，患者血清中葡萄糖、琥珀酸盐、柠檬酸盐和肌酸等的含量增高，低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、不饱和脂肪酸类和胆碱等水平下降。提示肝脏损伤引起糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环紊乱，进而引起能量代谢异常。

此外，呼雪庆等[64]运用全基因组甲基化芯片技术，进行了乙肝后肝硬化典型证候生物学基础观察。结果发现，与健康对照比较，湿热内蕴证、脾虚湿盛证和肝肾阴虚证各有57、68和94个差异DNA甲基化位点。其中，HLA-DRB1和ADAMTS9、NUDT1和YES1、APOA5和PRKCZ等基因的差异DNA甲基化可能分别与湿热内蕴证、脾虚湿盛证和肝肾阴虚证证候形成有关。研究提示DNA甲基化可能为乙肝后肝硬化证候分类的生物学依据之一。

4 展望

基因组学、蛋白质组学、代谢组学以及表观遗传组学是研究中医病证分子物质基础的主要内容，其分子的动态变化及其相互关系是研究中医病证分子机制的重要切入点。疾病是受到基因组学、蛋白质组学、代谢组学和表观遗传组学的调节网络“干扰”偏离常态而致，证候可能是疾病过程中基因、蛋白质、代谢和表观遗传水平受到“干扰”失衡后所发生的一种阶段性状态变化[65]，基因组学、蛋白质组学和表观遗传学组学能够说明可能发生的事件，而代谢组学则反映确实已经发生了的事情。因此，通过这些分子水平的组学研究，可能区分同种不同个体之间的“病证”表型差异，揭示“同病异证”、“异病同证”的分子机制。

尽管迄今中医病证的分子物质基础和分子机制研究取得一定进展，但缺乏基因、蛋白质、代谢水平和表观遗传水平各分子群之间相互关系的研究，尤其缺少基因、细胞、组织、器官和整体从低层次到高层次关联研究，这可能是今后乙肝后肝硬化的病证关系的重要研究方向。

乙肝后肝硬化的病证关系十分复杂，尽管中医对乙肝后肝硬化临床辨证及对症治疗等已经有了大量探索工作，但系统阐述其中医病证关系机制依然是中医药治疗乙肝后肝硬化的重要突破口。特别是随着系统生物学及生物大数据的快速发展，精准医疗已成为目前预防和治疗疾病的一种新方法。由于中医药精准医疗是以基因组学、蛋白质组学、代谢组学等技术为基础，通过大样本人群与特定疾病类型进行生物标志物的分析、鉴定、验证，从而精确寻找病证的致病原因及治疗靶点等[66]。因此，以病证结合为基础实现对乙肝后肝硬化患者进行个性化精准治疗必然越来越得到人们的认同和应用，从在提高乙肝后肝硬化诊治效率及预防等方面产生重要的作用。

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A Study on the Biological Substances of Traditional Chinese Medicine (TCM) Syndrome in Hepatitis B-Caused Cirrhosis

Liu Yamin, Shi Yulin, Chen Jian, Tang Chenchen, Su Shibing, Chen Qilong
(Research Center for TCM Complexity System, Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China)

Hepatitis B-caused cirrhosis (HBC) is a common pathological consequence of chronic hepatitis B at its final stage， which therapeutic efficacy has been challenging in its clinical treatment incredibly. Among the treatments of HBC traditional Chinese medicine (TCM) worked a special therapeutic efficacy. In the past decades，TCM forged the prospect of many chronic disease treatments. However， because of the indistinct relationship between “disease” and “syndrome”， TCM still encountered heaps of challenges in the treatment of HBC. In this study， underlying to the “disease” and “TCM syndrome” of HBC， we summarized the molecular mechanism of “disease” and the biological substances related to “TCM syndrome” from the aspects of genes， proteins， and metabolic and epigenetic levels， respectively. The application and prospects of the personalized TCM treatment of HBC was synopsized based on “disease-TCM syndrome” and TCM precision medicine， for the provision of a theoretical reference for the development of TCM precision treatment for HBC.

Traditional Chinese medicine， Hepatitis B-caused cirrhosis， disease-TCM syndrome， biological substances

10.11842/wst.2016.09.011

R2-031

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-04-18

修回日期：2016-06-13

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81473443）：基于动态生物网络的慢性乙型肝炎典型证候病证关系分子机制研究，负责人：陈启龙；上海市科学技术委员会自然科学基金面上项目（14ZR1438800）：基于转录组学的慢性乙型肝炎“同病异证”分子机制研究，负责人：陈启龙。

＊＊ 通讯作者：陈启龙，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：中医系统生物学及病证机制。