脑内小分子检测技术及人参皂苷入脑的研究进展＊

欧阳柳凤，朱珂璇，邵 晓，张 蔷，赵玉男＊＊

（1.延安大学医学院病理教研室 延安 716000；2.南京中医药大学基础医学院实验研究中心 南京 210046）

脑内小分子检测技术及人参皂苷入脑的研究进展＊

欧阳柳凤1，朱珂璇2，邵 晓2，张 蔷2，赵玉男2＊＊

（1.延安大学医学院病理教研室 延安 716000；2.南京中医药大学基础医学院实验研究中心 南京 210046）

许多中药在治疗中枢神经系统疾病均有疗效，但其作用机制并不清楚。本文简要介绍了血脑屏障（BBB）的生理组成，药物穿透BBB的途径，并介绍了3种主要针对脑内小分子物质的检测技术：高效液相色谱法、免疫组织化学法和放射性同位素标记法。这些技术将有助于小分子入脑的研究，并得出它们在脑组织内的分布以及判断是否能透过血脑屏障，从而探索它们中枢活性的作用模式。综合分析国内外的研究人员针对人参皂苷进行了其入脑的研究可得：人参皂苷可以到达BBB，作用于微血管内皮细胞或星形胶质细胞间接发挥中枢活性，至于是否能透过BBB到达神经元，仍需进一步的研究确认。

人参皂苷 血脑屏障 高效液相色谱法 免疫组化 放射性同位素标记

现代药理学研究发现，许多中药有效成分均具有中枢活性，能很好的治疗中枢神经系统疾病，如人参的有效成分人参皂苷[1]。然而，目前中药有效成分发挥中枢活性的作用模式并不明朗，其作用靶点可能位于中枢或外周。由于血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的存在，可以推断出中药有效成分中枢活性的作用模式可能为直接作用于神经元或是通过构成BBB的内皮细胞或星形胶质细胞间接发挥其中枢活性。因此，脑内小分子物质的检测主要有两个目标：一是判断其能否到达BBB；二是能否透过BBB进入脑组织，接触神经元。基于这种研究需求，本文简要介绍了血脑屏障的构成、药物穿透BBB的途径以及3种主要脑内小分子检测分析技术：高效液相色 谱 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）和放射性同位素标记法。这些技术将有助于研究中药有效成分中枢活性的作用模式；同时，本文还以人参皂苷为例，结合本实验室的研究结果，对人参皂苷入脑研究进行了归纳总结。

1 血脑屏障

1.1 BBB的基本组成及其生理作用

BBB是保护脑组织的天然生理屏障，是存在于脑组织和血液之间的一个复杂细胞系统，通过控制血脑两侧的物质转运，保证了中枢神经组织内环境的稳定[2]。它由紧密连接的血管内皮细胞、基底膜以及星形胶质细胞的足突组成，为BBB的“物理屏障”。毛细血管内皮细胞最重要的作用就是：使处于循环中的内源性和外源性物质无法轻易穿过自身进入脑组织。脑内的毛细血管内皮细胞有着连续的紧密连接、胞饮作用活力低、不存在开孔[3]，构成BBB并调控其通透性。星形胶质细胞构成血脑屏障的第二道屏障，星形胶质细胞的终足，贴附于毛细血管外周形成胶质膜，包绕了毛细血管85%的表面。胶质细胞膜也是血脑屏障不可缺少的一层，其作用不单是机械阻挡，在促进微血管内皮细胞的荷电性和诱导 BBB 功能等方面都发挥着重要作用[4，5]。终足还能释放化学因子和信号参与调控脑内毛细血管内皮细胞，在维持脑微血管内皮细胞的屏障特性和控制脑血流方面，也起决定性的作用[6]。BBB是具有生理功能的动态屏障。对于不同的化学物质，能够特异性、选择性地控制它们进入与排出脑组织[7]。在正常生理情况下仅允许气体分子及相对分子质量小于400-600的脂溶性小分子通过，除了被动保护作用外，它还能选择性地将脑内有害或过剩物质泵出脑外，从而保持脑的内环境稳定，使中枢神经系统能有效地执行功能。

1.2 穿透BBB的途径

BBB并不能阻止所有物质进出大脑，一些物质例如具有脂溶性、一定分子质量及电荷的小分子物质能够直接从血液扩散穿越BBB进入中枢神经系统。大多数物质必须通过与血管内皮细胞腔面细胞膜上所表达的特殊转运体和（或）受体相互作用，才可以穿过BBB，进行物质代谢。现已知物质透过BBB的机制有以下3种：①有些水溶性小分子物质可经在血管内皮细胞腔面及基底侧的转运体转运入脑；②相对分子量更大的亲水性物质可经胞吞或跨膜转运穿过BBB；③一些脂溶性小分子可通过被动扩散入脑。然而，不管通过何种方式入脑，药物在进入脑组织之前都会与血管内皮细胞或星形胶质细胞胞质存在的降解酶接触而被降解或代谢，其原型或代谢物最终会通过BBB的血管内皮细胞管腔侧所表达的排出泵（如：P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白2、乳腺癌耐药蛋白等）而被泵出，从而限制药物进入脑组织的量，可以看成BBB的“代谢屏障”[8，9]。

1.2.1 被动扩散

被动扩散仅适合小分子、亲脂性、非极性的物质。脂溶性气体如O2和CO2通过血管壁进行充分的交换；BBB允许脂溶性高的物质通过，如丁醇，不允许脂溶性低的分子通过，如甘露醇；BBB对许多物质的通透系数与这些物质的脂溶度即油-水比例系数呈正相关：如尼古丁和海洛因油-水比例系数较高，在一定范围内增加药物脂溶度就较易于进入脑组织[10]。

1.2.2 跨膜转运

大多数非脂溶性物质以及大分子物质主要通过跨膜转运透过BBB。这些物质必须与特异性的载体或受体结合，改变构相后跨过脂质膜性BBB，再与之分离。

水溶性小分子物质主要是通过血管内皮细胞血管腔面与基底侧上所表达的转运体转运穿过BBB。脑必需的每一种主要的营养物质都有特定的输送器[11]，这些输送器能识别营养物质分子，输送它穿过胞膜。葡萄糖是脑组织惟一的能量来源，BBB内皮细胞存在着的己糖转运装置即同型葡萄糖转运装置即是一个很好的例证。由于其转运为非耗能性过程，故不能逆浓度差运载葡萄糖。葡萄糖的净流量是由血浆中相对较高浓度所驱动。氨基酸跨膜方式与葡萄糖相似，但其转运体可以分为3种：①大分子中性氨基酸系统（Large Neutral Amino Acid，LNAA）或称亮氨酸系统，运送多种氨基酸，但对大分子氨基酸优先；②丙氨酸优先系统，仅仅存在于BBB的腔面；③必需氨基酸系统，主要转运精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等。葡萄糖转运体（Glucose Transporter 1，GLUT1）、氨基酸转运体（L-type amino Acid Transporter-1，LAT1）等特异的内源性载体，还可以和一些具有相近结构的小分子药物结合，从而协助它们穿过BBB。如水溶性的天麻素能直接入脑，并迅速代谢为天麻苷元，与其化学结构有关[12]。天麻素是由天麻苷元与一分子葡萄糖构成，苷元部分可视为葡萄糖的取代基，因此，可能是通过脑毛细血管内的内皮细胞上特异性的葡萄糖载体转运至脑内。

相对分子质量更大和（或）亲水的物质，如激素、转铁蛋白、胰岛素和脂蛋白主要利用血管内皮细胞的管腔侧高度表达的特殊受体进行转运，这些受体的作用是介导化合物经过胞吞或跨细胞转运穿过BBB。

在脑极后区、下丘脑正中隆起、后联合下器官、垂体后叶、松果体、脉络丛，存在“脑的特殊区”，其特点为血窦多，窦外仅有嗜银网状纤维包裹，无胶质突，毛细血管内皮有小孔，基膜不连续并与邻近胶质突分开，有较大的通透性。在这些特殊区域可允许某些大分子化合物，如激素和一些毒物少量进入，这可能具有它特殊的生物学意义。此外，离子通道和离子转运系统可传递电解质通过BBB。

2 脑内小分子检测技术

检测小分子物质是否入脑的方法有很多，主要有脑组织匀浆、脑脊液、脑部微透析液联合HPLC、免疫组织化学技术以及放射性同位素标记法等。为了探讨中药有效成分中枢活性的作用模式，探讨其作用于中枢还是外周，必须知道其能否到达BBB，以及能否透过BBB。HPLC配合脑组织匀浆法可判断待测物质能否到达BBB；如果能，即待测物质可能分布于构成BBB的星形胶质细胞和（或）血管内皮细胞；而其他的检测技术都能判断待测物质能否透过BBB；如果能，说明待测物质能直接作用于神经元。同时，免疫组织化学技术和放射性同位素标记法还能对待测物质进行定位，清楚明了地显示其具体分布于哪个细胞以及分布情况。这些检测分析技术，可以为研究中药有效成分的中枢作用模式提供直接明了的证据。

2.1 HPLC

HPLC为色谱法的一个重要分支，具有高压、高速、高效、高灵敏度以及应用范围广等特点，此外HPLC还具有样品不被破坏、色谱柱可反复使用以及易回收等优点。但HPLC也存在“柱外效应”，从而柱效率降低。液相色谱和质谱连接，即液-质联用（HPLC-MS）既具有液相强大的分离能力，又具有质谱高灵敏度、高选择性、高分辨率的特点，已经成为研究药物微量杂质分析鉴定、药物降解产物分析鉴定、药代动力学、组合化学高通量筛选等最用力的分析工具之一。它主要用来分析难挥发或者热不稳定、中性或者极性大的化合物，适用于大多数药物及其代谢产物的定性和定量研究。

2.1.1 脑组织匀浆

脑组织匀浆样品采集过程一般为：灌注后取脑组织，生理盐水匀浆，离心取上清，然后进行样品预处理，处理好的样品通过HPLC/HPLC-MS的检测方法检测。

采用HPLC检测脑组织匀浆液中的中药有效成分，是目前比较常用的检测方法。董小平等[13]将栀子苷给药大鼠后，各时间段分别取脑组织匀浆，HPLC法测定脑组织样本中栀子苷的量，发现冰片可提高栀子苷入脑量和入脑速度。川芎嗪微乳与其水溶液分别尾静脉给药，用HPLC法测定不同时间点小鼠血、肝、脑中的川芎嗪质量浓度，发现微乳改变了川芎嗪在小鼠血浆、肝、脑中药动学行为，提高了川芎嗪在脑、血、肝，特别是脑中的分布[14]。为了阐明苦碟子注射液中的4种黄酮类成分在血浆、心肌及脑组织的药代动力学特征，有研究采用超高效液相色谱－三重四级杆质谱联用技术（UPLC-MS/MS）建立同时测定苦碟子注射液中4种黄酮类成分在大鼠血浆、脑组织、心肌组织中浓度的含量[15]。米佳等[16]采用HPLC测定脑组织中天麻苷元含量，测得天麻与钩藤配伍对天麻苷元在大鼠脑组织中分布具有先抑制后促进的影响。不过，在脑组织匀浆中测定待测成分，并不能说明待测成分可以透过BBB，它也有可能仅存在构成BBB的星形胶质细胞和（或）血管内皮细胞中。此外，如果血液灌注不充分或不进行灌注，很容易得到假阳性结果。

2.1.2 脑脊液

目前，抽取脑脊液的方法主要有经延髓池穿刺和经侧脑室穿刺两种[17-20]。这两种方法相比较，经侧脑室穿刺操作较复杂，且易造成脑组织损伤和出血；而经延髓池穿刺方法简单、迅速，易于掌握，因此经延髓池穿刺抽取脑脊液法在各实验室更为常用。抽取的脑脊液经预处理后，采用HPLC/HPLC-MS进行检测分析。

HPLC-MS也是检测脑脊液中中药有效成分较常见的一种检测分析手段。脑脊液中如能检测到待测物质，则说明该物质能透过BBB。杨雁芳等[21]采用HPLC-MS/MS的方法，研究黄芩苷及配伍三七总皂苷在大鼠脑脊液药代动力学变化，在给药脑脊液中能检测到黄芪苷，并且其在脑脊液中的代谢不受三七总皂苷影响，认为黄芩苷能透过BBB。吴建明等[22]以大鼠口服疏肝解郁胶囊后，建立脑脊液HPLC指纹图谱，在脑脊液中检出5种成分。吴霜[23]建立HPLC测定法检测天麻的4种活性成分及代谢产物在脑脊液中的浓度，口服给药，发现其中有2种成分其原形和代谢产物穿透BBB能力强，还有2种其原形和代谢产物穿透能力弱。

2.1.3 微透析液

微透析技术是对活动动物特定脑区内灌流液进行实时监测的一种新方法。该项技术能在麻醉或清醒的生物体上使用，非常适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。脑内微透析技术有以下优势：①由于大分子的蛋白质不能透过半透膜，因此得到的脑透析液样品可以直接进行HPLC检测，样品不需提纯，且还可以避免酶对神经肽的降解作用。②透析液样品是在清醒的活体动物中获得，还可在透析的同时观察动物的行为。生物指标结合行为学，可更科学的解释实验结果。③这种技术可以节省实验动物，动物自身可成空白对照，且实验的空间准确性要优于其他技术手段。

脑内微透析技术与HPLC-MS这种灵敏的检测分析系统相结合，主要用于检测脑内细胞外液中许多神经递质如乙酰胆碱、去甲肾上腺素等及它们的代谢产物、小的肽类、游离氨基酸、磷酸乙醇胺、维生素、各种离子等浓度的变化。现代研究学者也将此法运用于检测脑内中药有效成分的动态浓度变化。吕允凤[24]考察不同剂量天麻素皮下及口服给药后，大鼠脑内的天麻素及其代谢产物天麻苷元的浓度变化。采用脑内微透析技术对大鼠进行在体动态取样，得到透析液以HPLC-串联四级杆质谱方法测定天麻素含量， HPLC-二极管阵列检测方法测定天麻苷元含量。结果显示，无论皮下及口服给药，天麻素浓度在不同脑区内均较低，天麻苷元脑内浓度则明显高于其原型天麻素。因此，天麻素的BBB透过能力差，而其活性代谢产物天麻苷元却能够较好地进入脑内发挥作用。方浩[25]以微透析技术和传统采样方法研究盐酸麻黄碱在大鼠额叶皮层细胞外液和血浆中药动学过程，比较研究两种方法所得主要药动学参数之间的区别与联系，探讨靶器官药动学研究方法。

但脑内微透析技术在应用中也存在不足之处：①实验操作较复杂，需能熟练使用微透析泵及立体定位仪，否则易造成较大的人为误差。②透析膜的回收率测定始终是一个没有很好解决的问题，回收率测定的不准确会直接限制该项技术在测定脑内物质绝对浓度时的应用。③微透析探头植入的位置、透析膜面积、截留分子量、温度、灌流速度、产生的损伤等都会对实验结果产生影响，同时探头植入大脑的时候可能会阻塞针孔，而且灌流的量也不好把握。④微透析探头的植入有可能破坏BBB，得到假阳性结果。

2.2 IHC

IHC是检测组织切片或细胞标本中某些物质分布及在组织或细胞中含量的定性、定量、定位研究的方法。IHC具有特异性强、敏感性高、定位准确和定量等优点。

应用IHC这种免疫分析技术，凡是能作为抗原或半抗原的物质都能用相应的抗体在组织或细胞中检测到。而采用IHC检测小分子物质中药有效成分，需要提供其抗体，这就需要应用到半抗原抗体技术。

2.2.1 半抗原抗体技术

随着免疫分析技术的不断发展进步，中药有效成分半抗原抗体技术已经被运用到中药的各个现代化研究领域。合成具有良好免疫原性的抗原是建立免疫分析技术的前提和关键所在。大多数中药的有效成分是小分子物质[26，27]，如有机酸类、黄酮类、木脂素类、蒽醌类、萜类及皂苷类，这些小分子物质一般都只有反应原性而没有免疫原性，因此需要偶联载体蛋白来形成完全抗原。目前，常见的偶联方法有以下几种：①有机酸类利用碳二亚胺法使羧基与载体上的氨基偶联，如绿原酸[28]、柚皮苷等[29]；②黄酮类利用混合酸酐法使酚羟基或羧基先与氯甲酸异丁酯生成混合酸酐，再与载体上的伯胺基偶联，如橙皮苷[30]；③木脂素类和蒽醌类利用重氮法，其活泼氢可与氮化修饰的载体偶联，如Agatharesinol[31]、大黄素等[32]；④萜类和皂苷类利用高碘酸钠法将糖基氧化成醛基，再与载体上的氨基偶联，如紫杉醇[33]、人参皂苷Re[34]等；⑤萜类利用半琥珀酸盐法将羟基与琥珀酸酐反应生成羧基，再偶联载体上的氨基，如雷公藤内酯醇[35]。

2.2.2 半抗原抗体技术的检测应用

近年来，大量的研究发现，半抗原抗体技术已经被广泛应用于各个方面：如酶联免疫检测、Knockout提取物、免疫亲和提取、分子育种以及细胞免疫组化等。其中，酶联免疫检测可用于中药质量控制和药代动力学研究。与色谱法相比，半抗原抗体技术具有易操作、样品前处理简单、反应速度快、费用低以及适用于大批量样品等优点，其灵敏度ELISA可以是HPLC的20倍以上，甚至达到液质的检测灵敏度。其检测结果也能与HPLC结果一致。Knockout提取物能选择性剔除复方或有效成分混合物中的某单个成分，在研究复合物中的某单一成分在复合物中所处的地位方面有着重要作用：如Yuan等[36]发现西洋参浆果有降低成年糖尿病小鼠血糖水平的作用，而剔除掉浆果中的人参皂苷Re成分，则降血糖的效应明显变弱，说明人参皂苷Re在浆果降血糖作用中占重要地位。免疫亲和提取是将半抗原抗体连接到固相载体上，再通过抗原抗体的特异性反应吸附样品中的半抗原，再将半抗原洗脱，通过HPLC或ELISA分析，测得复杂样品中该种小分子半抗原的含量。这种方法可以用于比较高效的样品前处理，或获得高纯度的中药有效成分。如用于对食品质量的监控：林维宣[43]以单克隆免疫亲和柱-HPLC测定酱油中伏马毒素B1、B2，以免疫亲和柱净化样品。用于免疫组化，则是将半抗原抗体作为一抗，因其抗原抗体的特异性结合，形成的免疫复合物，再与标记的二抗结合，可直观的检测到待测物质的分布，可为中药有效成分的作用靶点提供依据[37]。

2.3 放射性同位素标记法

同位素标记法是以放射影像学方法来证实其是否透过BBB或其在脑内的分布。因存在放射污染，目前该项检测技术已不被众多实验室考虑。但这项技术凭借其特有的追踪显影的优势，依然被应用于各个领域。

Rokka等[38]合成了一种（18）F-标记的姜黄素衍生物，并通过电子发射断层扫描（PET）转基因APP23小鼠模型的β-amyloid斑块，发现斑块在血液中清除的较快，得出姜黄素对于阿尔兹海默病（Alzheimer Disease，AD）有治疗效果。2型大麻素受体（Type 2 Cannabinoid Receptors，CB2）在神经炎症和神经退行性疾病中起着重要的作用，Mu等[39]为了证明大麻素对阿尔茨海默病是一种非常有前途的治疗方法，通过合成的放射性标记的CB2大鼠和小鼠脾片和脑片进行体外放射自显影，观察脑片和脾片动态正电子发射断层扫描，发现与CB2受体激动剂的结合性较高，说明这种方法可以用来研究大麻素是否可以穿越BBB。

综上所述，许多中药有效成分在中枢神经系统方面存在多种已知药效，然而关于其在脑内的具体作用部位方面尚无任何报导。采用HPLC配合脑组织匀浆法能初步判断中药有效成分能否到达BBB，HPLC配合脑脊液、透析液法以及IHC和放射性同位素标记法可以判断中药有效成分是否透过BBB，并且IHC和放射性同位素标记法还能直观显示药物具体到达哪个细胞以及分布量的多少。以上检测手段各有优劣，在研究中药有效成分的中枢作用模式方面亦各具千秋，这些技术手段为研究中药在脑内的作用靶点提供新的研究路径，为中枢神经系统药物的研发提供新的思路。

3 人参皂苷入脑的研究

人参是祖国传统名贵中药之一，人参皂苷为人参的主要有效成分。已有大量的现代研究证明，人参皂苷在中枢神经系统疾病方面有着很明确的疗效，并因其毒副作用小以及西药难以匹及的保健预防效果而成为临床研究热点。因此，关于人参皂苷作用机制的研究也日渐热门，人参皂苷可通过抗氧化、抗凋亡、调节蛋白表达、调节脑内兴奋性氨基酸含量等多种机制达到保护神经元的作用。人参皂苷的中枢活性可能有以下3种作用模式：①人参皂苷能透过BBB直接作用于神经元；②人参皂苷不能透过BBB，但是能到达BBB，通过构成BBB的内皮细胞或星形胶质细胞间接作用发挥其中枢活性；③人参皂苷不能透过BBB，也不能达到BBB，通过外周间接发挥其中枢活性。目前，有研究报道称发现人参皂苷能到达BBB，这掀起了一股探讨人参皂苷能否透过BBB的研究热潮。大多数研究趋向于人参皂苷不能透过BBB这个观点，但也有少量研究发现人参皂苷能透过BBB。因此，关于人参皂苷是否入脑及人参皂苷的具体作用部位的研究已经亟待开展。本实验室即以多种检测分析方法，来探讨人参的有效成分人参皂苷能否入脑并进一步研究其在小鼠脑组织中的分布，旨在明确人参皂苷作用于脑的具体部位，为中药有效成分的作用靶点研究提供研究方向，为指导临床用药提供依据。

3.1 人参皂苷能否到达BBB

当前，已有研究在脑组织匀浆中检测到了人参皂苷。陈新梅[40]在匀浆液样品中分别加入不同浓度的人参皂苷Rg1标准溶液，配制成高、中、低3个质量浓度的生物样品，然后按生物样品的处理方法进行处理后，利用HPLC测定其回收率和精密度，能在脑组织中测得人参皂苷Rg1。郝成欣[41]通过静脉注射人参皂苷Rb1，脑组织匀浆样品采用HPLC检测，测得人参皂苷Rb1在脑组织中5 min可达高峰，之后含量明显下降，30 min后不能再检测到。陈钢等[42]采用HPLC测定人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1在脑脊液和脑组织中的浓度，通过测定其回收率和精密度，得到其药代动力学参数，并在脑组织中检测出这3种物质。张颖等[43]灌胃给药，发现人参皂苷在塞络通作用下，能迅速吸收进入脑组织内。采用HPLC-MS的检测方法，测得人参皂苷单体Rg1、Re、Rb1、Rc在脑组织中含量较高。然而，这些文献研究中，脑组织均未灌注清洗或仅以PBS洗去表面浮血，脑组织匀浆液中可能含有血液而导致假阳性结果。

本实验室采用了HPLC-MS以及免疫荧光双染技术来探讨这个问题：HPLC-MS检测脑组织匀浆中的人参皂苷，并在获得脑组织匀浆样品过程中，特别以PBS心脏灌注清洗脑组织中的血液，排除样品中含有血液带来的假阳性结果，结果测得样品中含有人参皂苷Rg1。该实验结果支持人参皂苷能到达BBB；同时本实验室还采用半抗原抗体技术，将制得的人参皂苷抗体与胶质纤维酸性蛋白（Collagen Fibre Acidic Protein，GFAP）和von Willebrand因子（vWF）抗体两两联用，通过免疫荧光双染法在构成BBB的星形胶质细胞和血管内皮细胞中发现了人参皂苷。因此，本实验室通过实验认为人参皂苷能到达BBB[44]。

3.2 人参皂苷能否透过BBB

关于人参皂苷能否透过BBB，大部分学者认为人参皂苷不能透过BBB：如Wang等[45]发现无论体内还是体外实验，人参皂苷Rg1能透过BBB的能力都很弱。吴雪[46]发现芳香开窍药可助羟基红花黄色素A、葛根素、川芎嗪入脑，但并不能引人参皂苷Rg1入脑。但也有研究发现人参皂苷在通络药的作用下能透过BBB，甚至在无任何辅助药物时也能透过BBB。张颖等[43]发现，塞络通能促进人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc迅速入脑，尤其是Rg1和Re。李磊等[47]尾静脉给药大鼠，采用HPLC-MS测定方法，能在脑脊液中检测到人参皂苷Rg1，并发现解毒通络方并不影响其在脑脊液中的代谢。Xue等[48]收集大鼠大脑额叶中区、海马区以及侧脑室微透析液，采用HPLCMS来研究人参皂苷Rg1在脑内的药代动力学，发现Rg1能透过BBB。

本实验室也采用了HPLC-MS以及免疫荧光双染技术来探讨这个问题：以HPLC-MS的检测方法，并没有在脑脊液中检测到人参皂苷，这个实验结果似乎支持人参皂苷不能透过BBB；而在免疫荧光双染实验中，发现大多数神经元内没有人参皂苷，但还是有一些神经元上有人参皂苷阳性显示，说明有人参皂苷能透过BBB作用于少数神经元。至于脑脊液中没有检测到人参皂苷，原因可能和进入神经元的人参皂苷极性小或者含量低有关，因而在脑脊液中不能被HPLC-MS检测到，却能用免疫组织化学的方法捕捉到。

本实验室采用IHC的检测方法来测定人参皂苷在脑组织中的具体分布，这种免疫分析技术相较而言特异性强、灵敏度高、定位准确，能直观明了地显示人参皂苷的分布。但也不能排除假阳性的可能，人参皂苷在神经元中的阳性显色也可能仅仅是背景着色。为了使实验更具说服力，在未来的研究中，还需要采取更多的技术手段来佐证这个结论。如采用灵敏度更高的同位素标记法来追踪脑组织中人参皂苷单体或代谢产物等。因此，如何使实验结论更完善，并明确透过BBB的人参皂苷或代谢产物具体有哪些，这将是研究学者们下一步的研究任务。

4 小结

综上所述，小分子成分可通过被动扩散和主动转运，克服BBB的“物理屏障”和“代谢屏障”进入脑组织，分布于内皮细胞、星形胶质细胞和神经元等内。HPLC配合脑组织匀浆、脑脊液、透析液以及IHC和放射性同位素标记法可以用于小分子药物入脑的研究，并得出它们在脑组织内的分布以及判断是否能透过血脑屏障。基于上述技术，结合我们和其他研究人员的发现，目前基本可以得出人参皂苷可以到达BBB，通过作用于微血管内皮细胞或星形胶质细胞间接发挥中枢活性。至于是否能透过BBB到达神经元，大部分的研究结果都不支持。不过，我们采用IHC技术发现在少量神经元里有人参皂苷存在，该发现虽有所突破，但未来依然需要更多的证据来支持该结果。

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Studies on Detection Technology of Small Molecular Substance in Brain and Distribution of ginsenosides in Brain Tissues

Ouyang Liufeng1, Zhu Kexuan2, Shao Xiao2, Zhang Qiang2, Zhao Yunan2
(1. Laboratory of Pathological Sciences, Medical College, Yan'an University, Yan'an 716000, China; 2. Research Center, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

A lot of traditional Chinese medicine presented favorable efficacy on central nervous system disease. However， its functioning mode of central activity has not been clarified. This study briefly introduced the physiological compositions of blood brain barrier (BBB) and the pathways as drugs penetrated BBB， and three main techniques of the detections of small molecules in the brain tissues， involving high performance liquid chromatography (HPLC)， immunohistochemistry (IHC) and radioactive isotope labeling. These technologies was beneficial to detecting small molecules in the brain tissues and determining their penetration rate through BBB， in order to elucidate their functioning mode of central activities. Both domestic and foreign researchers have implemented volumes of studies on the detection of ginsenosides in the brain tissues， from which can be concluded that ginsenosides performed central activities as they reached BBB and targeted on microvascular endothelial cells or astrocytes. However， whether ginsenosides penetrated BBB and acted on neurons need verifying.

Ginsenoside， blood brain barrier， high performance liquid chromatography， immunohistochemistry，radioactive isotope labeling

10.11842/wst.2016.09.022

R966

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-09-20

＊ 国家自然科学基金委青年基金项目（81303246）：脑局部糖原代谢在人参总皂苷抗应激致海马结构可塑性损伤中的作用研究，负责人：赵玉男；江苏高校优势学科建设工程资助项目（中西医结合），负责人：黄熙。

＊＊ 通讯作者：赵玉男，副教授，主要研究方向：中药药理学。