耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因研究进展

杨勇文，李从荣（武汉大学人民医院，武汉430000）



耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因研究进展

杨勇文，李从荣
（武汉大学人民医院，武汉430000）

摘要：随着碳青霉烯类抗生素在临床上广泛使用，肠杆菌科细菌的耐药性问题日益严重。产碳青霉烯酶是耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）主要的耐药机制，编码这类酶的耐药基因包括A、B、D三类。A类酶主要以肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）为主；B类酶主要是在印度泛滥的新德里金属β内酰胺酶（NDM），可出现在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中；D类酶主要以肺炎克雷伯菌和大肠杆菌产苯唑西林酶-48（OXA-48）为主。大多数产KPC型酶菌株将造成院内感染，而产NDM、OXA-48酶菌株可造成医院和社区感染。虽然大部分CRE的耐药分子类型影响范围较为局限，但是其播散范围呈扩大趋势，且新近很多突变类型出现，值得广泛关注。

关键词：碳青霉烯酶；肠杆菌科细菌；细菌耐药；金属β内酰胺酶；苯唑西林酶

碳青霉烯类抗生素是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）和（或）头孢菌素酶肠杆菌科细菌的一线药物。随着碳青霉烯类抗生素在临床上广泛使用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）不断被报道，给临床治疗带来极大困难。CRE耐药分子广泛传播主要包括两方面原因：自身的基因结构（如周围的转座子和整合子）以及所属的质粒类型（如广谱质粒和窄谱质粒）；外界抗生素的压力选择，感控措施不严格和人口的高流动性。产碳青霉烯酶是CRE主要的耐药机制，不同类型碳青霉烯酶具有不一样的水解抗生素活性，耐药谱有所差异。按照Ambler分类原则，编码碳青霉烯酶的耐药基因可分为A、B、D三类［1］。本文将从这三个方面分别进行综述。

1　A类碳青霉烯酶

A类碳青霉烯酶的活性中心均含丝氨酸结构，可被酶抑制剂他唑巴坦和克拉维酸抑制，不被乙二胺四乙酸抑制。不能水解3代头孢，可造成青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药。第一个非金属A类碳青霉烯酶从阴沟肠杆菌中检出。随后，黏质沙雷菌酶（SME）在黏质沙雷菌分离，SME包括1～5五个亚型，均由染色体编码，散布于美国和加拿大［2，3］。水解亚胺培南β-内酰胺酶（IMI）CRE在美国、欧洲均有检出［4，5］。IMI基因大多位于染色体上，而在我国发现的阴沟肠杆菌携带的IMI-2型基因位于质粒上［6］。2000年，圭亚那超广谱β内酰胺酶1（GES-1）被报道，最初被认为是ESBLs，随后发现的部分GES亚型由于活性中心内的特定氨基酸置换使其具有水解碳青霉烯类抗生素的能力，其中GES2、GES4、GES5、GES6、GES11、GES14、GES18均可高效水解亚胺培南，故将这些GES酶归入A类碳青霉烯酶。目前，GES系列包含24个亚型。值得注意的是，编码GES-5酶的基因定位于I类整合子上，并且能在院内和环境中广泛传播［7］。GES-5是在肠杆菌科细菌中主要水解碳青霉烯类抗生素的GES酶，目前国内还没有相关报道。

A类碳青霉烯酶中最常见的是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC），能够水解青霉素类、β内酰胺酶抑制剂、头孢菌素类以及碳青霉烯类等各种抗生素。1996年第1株产KPC-2的肺炎克雷伯菌在美国卡罗来纳州检出。之后在多个国家和地区报道了KPC，已有22个KPC亚型被发现，均由相互之间个别氨基酸的突变产生，以位于质粒的KPC-2最为常见，这种质粒常携带ESBLs基因，表现出多重耐药甚至全耐药。我国KPC已在浙江等多个省市出现，情况较为严峻；在印度也有KPC的报道［8］。在欧洲（包括意大利、希腊等地区），旅行是造成产KPC肺炎克雷伯菌跨区域播散的重要原因；在中东地区，KPC可同时导致院内和社区爆发流行，提示中东地区可能是KPC的聚集地。值得注意的是，产KPC-2的肺炎克雷伯菌已经在世界范围内流行，KPC-2周围的遗传环境可能超过抗生素的选择压力起到举足轻重的作用。

2　B类碳青霉烯酶

B类碳青霉烯酶又称金属β内酰胺酶（MBLs），目前发现的所有金属酶均含有锌离子活性中心，可水解包括碳青霉烯类在内的具有β内酰胺环的抗生素，其活性不受克拉维酸、舒巴坦等酶抑制剂的影响，但巯基化合物及乙二胺四乙酸等金属离子螯合剂可使其失活。最常见的MBLs为新德里金属β内酰胺酶（NDM）、维罗纳整合子编码金属酶（VIM）和亚胺培南耐药金属酶（IMP），GIM-1和KHM-1偶有报道［9，10］。2009年，金属酶中的新德里1型金属酶（NDM-1）被报道，其来自于一名印度裔的瑞典患者分离鉴定的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌菌株［11］。NDM主要来自印度［12］，NDM的传播与印度环境中的携带有关。产NDM的CRE在法国和英国检出最多，英国检出的菌株经同源性分析证实与印度和巴基斯坦的菌株密切相关，提示印度很有可能是NDM的源头。跨境旅行是NDM广泛播散的重要原因［11］。目前，产NDM的CRE在全球均有报道。产NDM-1的CRE在我国虽不多见，但检出率呈逐年增多趋势，现北京已有报道［13］，虽然暂未形成大规模流行，但仍需警惕。

VIM主要分布在欧洲南部和地中海地区，IMP主要分布在我国东部沿海地区和日本。NDM-1与VIM-1／VIM-2的氨基酸同源性为32．4%，与其他酶相似性更低。NDM-1虽呈现出MBLs典型的耐药谱，对单环β内酰胺类抗生素氨曲南敏感。从NDM-1被发现以来，已报道了8个亚型（NDM-1～8）。与NDM-1相比，NDM-4、NDM-5和NDM-7对碳青霉烯类抗生素水解活性增加。1997年，VIM首次在意大利自铜绿假单胞菌检出［14］，已发现41种亚型。VIM主要在铜绿假单胞菌中检出，但其启动子P1在大肠埃希菌中的作用更强，以VIM-2亚型最为常见［15］。1991年，Osano等首先在日本分离的黏质沙雷菌检出IMP-1，编码基因定位于染色体，已发现48种亚型。VIM和IMP的同源性小于20%，均由染色体或质粒介导，其活性中心的氨基酸残基需结合结合两个锌离子才能发挥催化作用。

3　D类碳青霉烯酶

D类β内酰胺酶也称为苯唑西林酶（OXA），目前已发现400余种，大多对碳青霉烯类抗生素产生低水平耐药，不能水解氨曲南。肠杆菌科细菌中主要流行的是OXA-48，对亚胺培南有较高的水解活性。当OXA-48存在外膜蛋白缺失、外排泵亢进等耐药机制的作用时，CRE可表现对碳青霉烯类抗生素的高水平耐药［16］。OXA-48上游含有IS1999插入序列，具有启动子的作用，可使酶表达水平增强，并参与基因的同源重组。在中国、伊朗、欧洲、美国及日本均有关于该酶的报道。OXA-48定位于高转换率的广谱接合型质粒上，能够跨菌属传播［17］。其次为由OXA-48点突变而来OXA-181，二者仅存在4个氨基酸的差异，编码基因均位于质粒上，耐药谱相似，但OXA-181周围的基因结构与OXA-48不同。OXA-181已在挪威、英国、法国等欧洲国家被报道，经多位点序列分型同源性分析发现与印度的分离株有联系。证明产OXA-181的CRE来源于印度［18］。

在阿根廷分离的肺炎克雷伯菌中先后发现OXA-163和OXA-247［19］。尽管OXA-163活性比OXA-48低，但可水解广谱头孢菌素且部分地被克拉维酸抑制，与ESBLs的耐药谱极为相似，值得临床微生物工作者关注。经分子流行病学和分子生物学相关实验证明，OXA-247基因由OXA-163单个氨基酸突变而来，二者具有相同抗生素的水解活性［20］。目前，在突尼斯和阿尔及利亚分离鉴定的肺炎克雷伯菌中发现OXA-204。通过比对OXA-204和OXA-48的氨基酸一级结构发现，后者2个氨基酸被取代后产生OXA-204。在法国分离鉴定的肺炎克雷伯菌中发现OXA-232，其来自于毛里求斯和印度［21］。由OXA-18点突变而来的OXA-232与OXA-48相比有5个氨基酸被取代，OXA-232水解碳青霉烯类抗生素的能力更弱。这些被取代的氨基酸基团水解碳青霉烯类的机制有待研究。最近，在美国分离鉴定的肺炎克雷伯菌发现同时产OXA-232与NDM-1，其来源于印度［22］。尽管大部分OXA亚型仅仅是小规模流行，但近年来OXA突变速度非常之快，且丝氨酸酶和金属酶有同时作用的趋势，需引起足够的警惕。

4　结语

目前，碳青霉烯类抗生素作为临床治疗产ESBLs菌株的首选药物正受到严峻考验，CRE给临床治疗方案的选择带来了极大挑战。联合多种抗菌药物治疗的过程中，这类细菌面临新的选择压力可进一步筛选出新的耐药机制，并且碳青霉烯酶均可在染色体或质粒的介导下垂直或水平传播。临床微生物室应建立一套耐药基因初筛体系，快速准确地诊断CRE；临床医生应审慎、合理地使用碳青霉烯类抗生素，密切关注医院感控部门的耐药情况；院感办应采取有效措施预防医院感染的爆发。多方协作以防止CRE耐药基因和耐药细菌的广泛传播。

参考文献：

［1］Ambler RP，Coulson AF，Frere JM，et al．A standard numbering scheme for the class A β-lactamases［J］．Biochem J，1991，276 （pt1）：269-270．

［2］Fairfax MR，Queenan AM，Lephart PR，et al．Detection of two SME-1 carbapenemase-producing Serratia marcescens in Detroit ［J］．Diagn Microbiol Infect Dis，2011，71（3）：325-326．

［3］Naas T，Nordmann P．Analysis of a carbapenem-hydrolyzing class A β-lactamase from Enterobacter cloacae and of its LysR-type regulatory protein［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（16）：7693-7697．

［4］Rasmussen BA，Bush K，Keeney D，et al．Characterization of IMI-1 beta-lactamase，a class A carbapenem-hydrolyzing enzyme from Enterobacter cloacae［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996，40（9）：2080-2086．

［5］Osterblad M，Kirveskari J，Hakanen AJ，et al．Carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae in Finland：the first years（2008-11）［J］．J Antimicrob Chemother，2012，67（12）：2860-2864．

［6］Yu YS，Du XX，Zhou ZH，et al．First isolation of blaIMI-2 in an Enterobacter cloacae clinical isolate from China［J］．Antimicrob A-gents Chemother，2006，50（4）：1610-1611．

［7］Manageiro V，Ferreira E，Canica M，et al．GES-5 among the βlactamases detected in ubiquitous bacteria isolated from aquatic environment samples［J］．FEMS Microbiol Lett，2014，351（1）：64-69．

［8］Kumarasamy K，Kalyanasundaram A．Emergence of Klebsiella pneumoniae isolate co-producing NDM-1 with KPC-2 from India ［J］．J Antimicrob Chemother，2012，67（1）：243-244．

［9］Castanheira M，Toleman MA，Jones RN，et al．Molecular characterization of a β-lactamase gene，blaGIM-1，encoding a new subclass of metallo-β-lactamase［J］．Antimicrob Agents Chemother，2004，48（12）：4654-4661．

［10］Sekiguchi J，Morita K，Kitao T，et al．KHM-1，a novel plasmidmediated metallo-β-lactamase from a Citrobacter freundii clinical isolate［J］．Antimicrob Agents Chemother，2008，52（11）：4194-4197．

［11］Yong D，Toleman MA，Giske CG，et al．Characterization of a new metallo-β-lactamase gene，bla NDM-1，and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumonia sequence type 14 from India［J］．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（12）：5046-5054．

［12］Dortet L，Poirel L，Nordmann P．Worldwide dissemination of the NDM-type carbapenemses in Gram-negative bacteria［J］．Biomed Res Int，2014，2014：249856．

［13］Zhou G，Guo S，Luo Y，et al．NDM-1 producing strains，family Enterobacteriaceae，in hospital，Beijing，China［J］．Emerg Infect Dis，2014，20（2）：340-342．

［14］Lauretti L，Riccio ML，Mazzariol A，et al．Cloning and characterization of blaVIM，a new integron-borne metallo-β-lactamase gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate［J］．Antimicrob A-gents Chemother，1999，43（7）：1584-1590．

［15］Poirel L，Pitout JD，Nordmann P．Carbapenemases：molecular diversity and clinical consequences［J］．Future Microbiol，2007，2 （5）：501-512．

［16］Poirel L，Naas T，Nordmann P．Diversity，epidemiology，and genetics of class D β-lactamases［J］．Antimicrob Agents Chemother，2010，54（1）：24-38．

［17］Potron A，Poirel L，Nordmann P．Derepressed transfer properties leading to the efficient spread of the plasmid encoding carbapenemase OXA-48［J］．Antimicrob Agents Chemother，2014，58（1）：467-471．

［18］Potron A，Nordmann P，Lafeuille E，et al．Characterization of OXA-181，a carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase from Klebsiella pneumoniae［J］．Antimicrob Agents Chemother 2011，55（10）：4896-4899．

［19］Poirel L，Castanheira M，Carrer A，et al．OXA-163，an OXA-48-related class D β-lactamase with extended activity toward expanded-spectrum cephalosporins［J］．Antimicrob Agents Chemother 2011，55（6）：2546-2551．

［20］Gomez S，Pasteran F，Faccone D，et al．Intrapatient emergence of OXA-247：a novel carbapenemase found in a patient previously infected with OXA-163-producing Klebsiella pneumoniae［J］．Clin Microbiol Infect，2013，19（5）：E233-235．

［21］Potron A，Rondinaud E，Poirel L，et al．Genetic and biochemical characterisation of OXA-232，a carbapenem-hydrolysing class D βlactamase from Enterobacteriaceae［J］．Int J Antimicrob Agents 2013，41（4）：325-329．

［22］Doi Y，O′Hara JA，Lando JF，et al．Co-production of NDM-1 and OXA-232 by Klebsiella pneumoniae［J］．Emerg Infect Dis，2014，20（1）：163-165．

收稿日期：（2015-10-09）

通信作者：李从荣（E-mail：1225870670＠qq．com）

基金项目：国家临床重点专科建设项目（财社2010305）。

中图分类号：R378

文献标志码：A

文章编号：1002-266X（2016）02-0096-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．043