层流剪切应力对高脂环境下白细胞-内皮细胞黏附的影响及其机制

李燕玲，何小洪，张焰，钟挺挺，3，董吁钢，马虹，郑振声

(1中山大学附属第一医院，广州510080；2中山大学附属第三医院；3中山大学附属第二医院)

层流剪切应力对高脂环境下白细胞-内皮细胞黏附的影响及其机制

李燕玲1，2，何小洪1，张焰1，钟挺挺1，3，董吁钢1，马虹1，郑振声1

(1中山大学附属第一医院，广州510080；2中山大学附属第三医院；3中山大学附属第二医院)

目的 探讨层流剪切应力对高脂环境下白细胞-内皮细胞黏附的影响及其机制。方法 以氧化型低密度脂蛋白造成高脂环境，诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤，分别以0、5、25 dyne/cm2层流剪切应力对损伤后的HUVECs干预4 h(分别记为0、5、25 dyne/cm2组)。采用人白血病淋巴瘤细胞株U937行白细胞-内皮细胞黏附试验，计算每100个HUVECs上黏附的U937细胞数；采用激光扫描共聚焦显微镜观察HUVECs细胞膜上的β1整合素抗体荧光信号强度，流式细胞术检测β1整合素阳性率。结果 0 dyne/cm2组、5 dyne/cm2组和25 dyne/cm2组黏附的细胞数量依次降低(P均<0.05)，细胞膜上的β1整合素抗体荧光信号强度逐渐减弱，β1整合素阳性率分别为98.98%±0.36%、88.58%±3.34%、81.28%±5.19%；0 dyne/cm2组β1整合素阳性率明显高于25 dyne/cm2组(P<0.05)，0 dyne/cm2组与5 dyne/cm2组比较、5 dyne/cm2组与25 dyne/cm2组比较均无统计学差异(P均>0.05)。结论 在一定范围内适当提高层流剪切应力能够降低高脂环境下内皮细胞上黏附的白细胞数量，机制可能与降低内皮细胞膜β1整合素表达有关。

动脉粥样硬化；层流剪切应力；内皮细胞；白细胞；β1整合素

内皮细胞活化是早期动脉粥样硬化(AS)的重要表现，活化的内皮细胞表达选择素、白细胞黏附因子、整合素以及趋化因子，导致白细胞黏附于内皮细胞层，并最终定植于血管壁[1，2]。白细胞与内皮细胞之间的黏附被认为是导致血管炎症的重要原因，其机制尚不十分明确[3]。研究发现，动脉发生弯曲、分叉以及发出分支的地方是AS好发之处，也是剪切应力水平低下并易发生湍流之处[4]。内皮细胞所在的血流环境对其功能以及血管稳态具有非常重要的影响[5]。一般认为，层流剪切应力决定血管内粥样硬化的分布，但内皮细胞如何将层流剪切应力这种机械刺激转化为生化信号尚不清楚。2012年5月～2015年6月，我们观察了层流剪切应力对高脂环境下白细胞-内皮细胞黏附的影响，现分析结果并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，人白血病淋巴瘤细胞株U937(中山大学实验中心细胞库)。人内皮细胞培养基、胰酶(0.25%胰酶+0.05% EDTA)、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)，氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL，广州益元生物科技有限公司)，PE标记鼠抗人β1整合素抗体(上海玉博生物科技有限公司)，牛血清蛋白(美国Mpbio公司)。台式离心机(Universal 32,德国Hettich公司)，平行板流动小室(美国GlycoTech公司)，激光扫描共聚焦显微镜(Fluoview FV 500-Ⅳ 81,日本Olympus公司)，流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)，倒置显微镜(Eclipse TS100,日本Nikon公司)。

1.2 细胞培养 ①HUVECs培养：参照Kartikasari等[6]的方法，从新鲜脐带中提取HUVECs。从脐静脉的一端置管，灌入0.2% Ⅱ型胶原酶原液，37 ℃反应15 min。将含有内皮细胞的消化液收集后离心，弃上清，使用含10% FBS的内皮细胞培养基重悬细胞，放入37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。将培养后的细胞融合，使用胰酶进行消化并分种至培养皿中，当细胞生长至融合时即可用于试验，用于试验的细胞传代不超过两代。②U937细胞培养：按照悬浮细胞培养方法，采用含10% FBS的RPMI-1640培养基培养U937细胞，2～3天进行换液。换液时将细胞悬液转移至15 mL离心管，100 r/min离心5 min；弃上清，加入4 mL完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至培养瓶继续培养。

1.3 OX-LDL诱导HUVECs损伤模型及体外层流剪切应力系统的建立 将OX-LDL溶于含有10% FBS的DMEM培养基中，最终有效浓度调整为10 μg/mL。将层流室与灌有高浓度(10 μg/mL)OX-LDL培养基的管道系统连接起来，使用蠕动泵驱动管道中的培养基流动，31-005垫片(宽度为1.00 cm，厚度为0.010 inch)接入层流小室。将种有HUVECs的培养皿接入层流小室中，参照Kemeny等[7]的方法，使培养基流经层流小室分别产生0、5、25 dyne/cm2的层流切应力(分别记为0、5、25 dyne/cm2组)，并直接作用于HUVECs，作用时间为4 h。层流剪切应力= 6 μQ/wh2，μ为流体黏滞度，Q为液体流速(mL/s)，w为垫片宽度(cm)，h为垫片厚度(inch)。

1.4 相关指标观察

1.4.1 层流剪切应力对白细胞-内皮细胞黏附的影响 参照McCracken等[8]的方法，改进后进行白细胞-内皮细胞黏附试验。如1.3所述，在含有OX-LDL的培养基中，三组HUVECs分别经0、5、25 dyne/cm2的层流剪切应力干预4 h，将整个层流小室放于装有录影照相机的倒置显微镜载物台上。将细胞浓度为5×105/mL的U937单细胞悬液置换上述含OX-LDL的培养基，调节泵度，使剪切应力为5 dyne/cm2。U937细胞在回路中随灌流液流经层流小室，与HUVECs接触5 min，用PBS将滞留在HUVECs表面而没有黏附的U937细胞洗掉。20倍显微镜下任意选取10个视野进行拍照，计数每个视野黏附在HUVECs上的U937数目(M)以及该视野的HUVECs数目(N)。计算每100个内皮细胞上黏附的U937细胞数(K)，即K=100×M/N。每组进行3次试验。

1.4.2 HUVECs细胞膜β1整合素表达 ①β1整合素抗体荧光信号强度：使用4%多聚甲醛固定上述干预后的三组HUVECs，1% FBS于37 ℃条件下封闭30 min。PE标记的鼠抗人β1整合素抗体(20 μL∶200 μL)溶液覆盖HUVECs，4 ℃避光过夜。使用DAPI(1 μg/mL)对细胞核进行染色，采用激光扫描共聚焦显微镜观察HUVECs细胞膜上的β1整合素抗体荧光信号强度。②β1整合素阳性率：采用流式细胞术。胰酶消化上述干预后的三组HUVECs，收集细胞并进行离心，弃上清。取PE标记的鼠抗人β1整合素抗体溶液重悬HUVECs，37 ℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定。采用流式细胞仪分析结果，计算HUVECs细胞膜上的β1整合素阳性率。每组进行5次试验。

2 结果

2.1 三组黏附细胞数量比较 白细胞-内皮细胞黏附试验显示，U937细胞大量黏附于OX-LDL作用后的HUVECs表面。0 dyne/cm2组、5 dyne/cm2组和25 dyne/cm2组黏附的U937细胞数量分别为(78.54±6.96)、(42.61±3.19)、(29.19±5.44)个，多组间比较有统计学差异(P<0.05)；0 dyne/cm2组黏附的细胞数量明显多于5 dyne/cm2组和25 dyne/cm2组，5 dyne/cm2组明显多于25 dyne/cm2组(P均<0.05)。

2.2 三组β1整合素表达比较 激光共聚焦检测结果显示，0 dyne/cm2组、5 dyne/cm2组和25 dyne/cm2组HUVECs细胞膜上的β1整合素抗体荧光信号强度逐渐减弱，见插页Ⅱ图3。流式细胞术检测结果显示，0 dyne/cm2组、5 dyne/cm2组和25 dyne/cm2组β1整合素阳性率分别为98.98%±0.36%、88.58%±3.34%、81.28%±5.19%，0 dyne/cm2组β1整合素阳性率明显高于25 dyne/cm2组(P<0.05)，0 dyne/cm2组与5 dyne/cm2组比较、5 dyne/cm2组与25 dyne/cm2组比较均无统计学差异(P均>0.05)。

3 讨论

粥样硬化是脂质引起的血管慢性炎症反应，最终会导致血管狭窄甚至闭塞，从而引起一系列的心血管事件。血液循环中白细胞黏附到内皮细胞层被认为是AS发生的最早期事件，血管内皮细胞活化后，血液中的白细胞黏附于内皮细胞，粥样硬化病变开始形成。有研究从高脂血症患者血液中分离出白细胞并进行体外试验，发现这些白细胞更容易黏附于内皮细胞，且内皮细胞整合素及其他黏附分子表达均增加[9]。

在众多的因素中，OX-LDL被认为是导致内皮细胞活化及其功能障碍的最主要因素，其具有促进白细胞聚集及其与内皮细胞黏附的作用。此外，局部动力学因素特别是层流剪切应力，可显著影响AS的发病进程[10]。既往研究发现，在AS的好发之处，其层流剪切应力水平较低[5]。在这些低剪切应力的地方，粥样斑块更容易形成并且更易破裂出血[11]，且在高脂环境下，脂质更容易聚集于血管壁，白细胞也更容易聚集，从而促进斑块的发生及发展。相反，在层流剪切应力高的地方，促粥样硬化基因表达下降，抗粥样硬化基因表达增加，可对抗AS的形成[12]。本研究结果发现，0 dyne/cm2组、5 dyne/cm2组和25 dyne/cm2组黏附的U937细胞数量依次降低，且组间比较均具有统计学差异；提示高层流剪切应力能够抑制OX-LDL导致的白细胞与内皮细胞之间的黏附，并且随着层流剪切应力的升高，这种抑制作用明显增强。

整合素是跨膜糖蛋白异质体，由α及β两个亚单位组成，每个亚单位由1个巨大的胞外基团、跨膜基团以及小的胞内基团组成。既往研究发现，活化的β1整合素可介导U937细胞对内皮细胞的黏附。在apoE-/-小鼠模型中，阻断β1整合素能够抑制粥样斑块的形成。β1整合素能够同时转导机械信号，机械刺激能够使其表达成倍增加[13～16]。许多细胞分子结构具有转导机械信号的功能，如离子通道、整合素、多糖蛋白质复合物等，这些分子结构在胚胎发育及许多生理过程中发挥重要作用[17]。但是在非正常状态，如OX-LDL及促炎因子的刺激下，这些分子结构基因的过度表达会导致疾病的发生[18]。本研究激光扫描共聚焦检测和流式细胞术检测结果表明，随着层流剪切应力的增加，内皮细胞膜β1整合素抗体荧光信号强度逐渐减弱、β1整合素阳性率逐渐降低，其中25 dyne/cm2组β1整合素阳性率明显低于0 dyne/cm2组，提示层流剪切应力抑制白细胞与内皮细胞黏附的作用机制可能与降低内皮细胞膜表面β1整合素表达有关。

综上所述，在一定范围内适当提高层流剪切应力能够减少高脂环境下内皮细胞上黏附的白细胞数量，机制可能与降低内皮细胞膜β1整合素表达有关。但层流剪切应力抑制β1整合素表达的分子机制仍需进一步研究。

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Effect of laminar shear stress on leukocyte endothelial adhesion under hyperlipemia and its mechanism

LIYanling1,HEXiaohong,ZHANGYan,ZHONGTingting,DONGYugang,MAHong,ZHENGZhensheng

(1TheFirstAffiliatedHospitalOfSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Objective To investigate the effect of laminar shear stress on leukocyte-endothelial adhesion in the environment of hyperlipemia and its mechanism. Methods We used oxidized low density lipoprotein (OX-LDL) to make the environment of hyperlipemia then induced the injuries of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The laminar shear stress at 0, 5 and 25 dyne/cm2was used to intervene HUVECs for 4 h which was taken as the 0, 5 and 25 dyne/cm2groups. U937 cells were applied in the leukocyte-endothelial adhesion experiment, in which the number of U937 cells adherent to HUVECs was counted. Immunofluorescent confocal laser scanning and flow cytometry were respectively used to analyze the fluorescence signal intensity and positive rate of integrin β1in HUVECs. Results The number of leukocyte-endothelial adhesion cells was gradually decreased from 0 dyne/cm2, 5 dyne/cm2and to 25 dyne/cm2groups (allP<0.05). The fluorescence signal intensity of integrin β1in cytomembrane weakened from 0 dyne/cm2, 5 dyne/cm2and to 25 dyne/cm2. The positive rates of integrin β1in 0 dyne/cm2group, 5 dyne/cm2group and 25 dyne/cm2group were 98.98±0.36%, 88.58±3.34% and 81.28±5.19%, respectively, and the positive rate of integrin β1in 0 dyne/cm2group was significantly higher than that in 25 dyne/cm2group (P<0.05), while there was no statistical difference between 0 dyne/cm2and 5 dyne/cm2groups, neither between 5 dyne/cm2and 25 dyne/cm2groups (allP>0.05). Conclusion Increasing laminar shear stress to a relatively high level within proper range could inhibit leukocyte-endothelial adhesion in the environment of hyperlipemia, and its mechanisms may be related to the down-regulation of integrinβ1expression.

atherosclerosis; laminar shear stress; endothelial cells; leukocytes; integrin β1

国家自然科学基金资助项目(30871047)。

李燕玲(1987-)，女，硕士，研究方向为动脉粥样硬化。E-mail： lililingcom@sina.com

张焰(1967-)，女，副主任医师，研究方向为动脉粥样硬化及增强型体外反搏。E-mail： zhangyangzzsyy@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.005

R543.5

A

1002-266X(2016)16-0015-04

2015-11-12)