先天性显性脊椎裂胎鼠宫内干细胞移植新方法的建立

赵桂锋，刘波，苗佳宁，吴迪，李慧，黄天楚，袁正伟

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004)

先天性显性脊椎裂胎鼠宫内干细胞移植新方法的建立

赵桂锋，刘波，苗佳宁，吴迪，李慧，黄天楚，袁正伟

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004)

目的 建立一种先天性显性脊椎裂胎鼠宫内干细胞移植的新方法。方法 选择孕16、17、18天的雌性大鼠各30、30、26只，制备先天性显性脊椎裂胎鼠模型。采用胎仔外科、显微外科和显微注射技术，将转染绿色荧光蛋白基因的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植到脊椎裂胎鼠脊髓中。大鼠孕20天时剖腹、取胎，计算胎鼠成活率；制作胎鼠脊髓切片，荧光显微镜下观察胎鼠脊髓干细胞移植情况。结果 接受手术的孕鼠86只，孕20天成活81只，成活率为94.2%。行干细胞移植的先天性显性脊椎裂胎鼠258只，共取出198只，成活率为76.7%(198/258)，其中胎龄为16、17、18天的胎鼠成活率分别为72.1%(80/111)、77.3%(78/101)、87.0%(40/46)。荧光显微镜下观察胎鼠脊髓切片，可见呈现绿色荧光的MSCs；干细胞移植成活的胎鼠195只，成活率为98.5%(195/198)。结论 成功建立先天性显性脊椎裂胎鼠宫内干细胞移植的新方法；该方法干细胞成活率较高，可用于神经管畸形治疗。

先天性显性脊椎裂；胚胎；显微手术；显微注射；骨髓间充质干细胞；移植；大鼠

先天性神经管畸形(NTDs)是一种严重的出生缺陷[1], 包括无脑、脑膨出、肛门直肠畸形和脊椎裂等，主要为神经管闭合异常所致。 NTDs的发病机制尚不清楚，目前认为是胚胎在母体内发育过程中多种基因调控异常和胚胎发育环境有害因素相互作用的结果[2～4]。近年来干细胞移植技术解决了中枢神经细胞不能修复和再生的难题,为神经系统疾病的治疗带来希望。2010年8月～2014年11月，我们对先天性显性脊椎裂胎鼠模型行骨髓间充质干细胞(MSCs)移植,成功建立了NTDs胎鼠宫内干细胞移植新方法，为NTDs的干细胞治疗提供思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 成年雌性Wistar大鼠由中国医科大学附属盛京医院动物实验室提供[合格证号：SCXK(京)2009-0004]，体质量220～250 g，在SPF级环境下饲养，阴道涂片确认未孕[5～7]。维甲酸(美国Sigma公司)，显微镊子、显微剪刀、显微针持(张家口奥斯卡医疗器械有限公司)，6-0显微缝合线(杭州爱普医疗器械股份有限公司)，显微注射针(美国Nikon公司)，手术显微镜(德国Moller公司)，手术恒温加热垫(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 先天性显性脊椎裂模型建立及处理 取合笼后怀孕的雌性Wistar大鼠86只，参照李勇等[8]、蔡炜嵩等[9]的方法，于大鼠怀孕第10天上午9:00～9:30，按135 mg/kg给予4%维甲酸灌胃,采用显微外科及胎仔外科技术制备先天性显性脊椎裂胎鼠模型(以下称脊椎裂胎鼠)。取孕16、17、18天的大鼠各30、30、26只，10%水合氯醛按0.32 mL/100 g腹腔麻醉，仰卧位固定于手术加热垫上(预设38 ℃)，肛门直肠内测温。调整手术显微镜及座椅，大鼠常规腹部消毒，腹部正中开腹，暴露双侧子宫角，术野外围铺温盐水纱布。将一侧子宫角轻轻拉出放置于纱布上，清点胚胎数量，确认胚胎头尾位置，调整胚胎子宫部位至手术显微镜视野内。镜下确认胎鼠脊椎裂部位，于对应子宫壁部位做一预置缝线荷包[10]。逐层剪开子宫壁长约2 mm，暴露羊膜，轻轻推压子宫壁，调整脊椎裂位置至清晰暴露于镜下术野(此时手术显微镜放大倍数为20倍，可清晰见到胎鼠的脊髓)，滴加37 ℃预热温生理盐水保温、保湿。

1.3 胎鼠脊髓MSCs的绿色荧光蛋白基因转染及移植 参照杨洋等[11]、李志勇等[12]的方法，于无菌条件下取4周龄大鼠的MSCs,采用全骨髓贴壁细胞培养法进行原代培养,腺病毒-EGFP(感染复数为300～500)转染。暴露孕鼠羊膜，采用独立口吸显微注射技术[13]抽吸转染绿色荧光蛋白基因的MSCs约2 μL。将显微注射针移至镜下术野，迅速刺入羊膜，轻划羊膜，使羊水外流。对准脊髓，进针约2 mm，针头保持2 s，缓慢后退针头并吹出干细胞。干细胞完全注入后，保持针头在组织内不动，同时保持注射针内压力，停止2 s，减少因组织压力导致移植干细胞的外溢，之后迅速退出针头(显微注射完毕)。轻拉预先缝合在子宫壁上的荷包缝线，打结缝合，检查子宫壁修复情况，必要时加针缝合加固。将子宫轻轻推回腹腔，并轻轻挤压腹壁，使其归位并避免肠梗阻。其他胚胎间隔给予同样操作后关腹。

1.4 相关指标观察

1.4.1 胎鼠成活情况 取接受干细胞移植的孕20天大鼠，10%水合氯醛按0.32 mL/100 g腹腔麻醉，固定于手术托盘中。常规腹部消毒，腹部正中开腹，暴露双侧子宫角，术野外围铺温盐水纱布。将一侧子宫角轻轻拉出放置在纱布上，清点胚胎数量，按照手术记录查找接受建模的胚胎。打开子宫壁，剖出胚胎，以胚胎有心跳及活动记为胎鼠成活。计算不同孕龄大鼠的胎鼠成活率。

1.4.2 干细胞移植成活情况 将经干细胞移植的成活胎鼠脊髓避光小心剥离取出，OCT包埋、避光冰冻切片，荧光显微镜下观察移植干细胞，以出现绿色荧光视为干细胞移植成活，计算干细胞移植胎鼠成活率。

2 结果

接受手术的孕鼠86只，孕20天成活81只，孕鼠成活率为94.2%。行干细胞移植的脊椎裂胎鼠258只，共取出接受干细胞移植的胎鼠198只，成活率为76.7%(198/258)；其中胎龄为16、17、18天的胎鼠成活率分别为72.1%(80/111)、77.3%(78/101)、87.0%(40/46)。荧光显微镜下观察，胎鼠脊髓切片可见呈现绿色荧光的MSCs，见插页Ⅱ图1。干细胞移植成活的胎鼠195只，成活率为98.5%(195/198)，证明干细胞移植成功。

3 讨论

目前, NTDs的治疗尚无突破性进展,主要原因为神经损伤的修复极其困难。近年来干细胞移植已深入到各方面科研研究中[14，15]。本研究利用显微注射、显微外科和胎仔外科技术，将转染绿色荧光蛋白基因的MSCs移植入脊椎裂胎鼠的脊髓损伤部位,在大鼠孕20天剖腹取出胎鼠，干细胞成活率为98.5%。因此，我们认为采用本研究方法对脊椎裂胎鼠进行干细胞移植具有较高的干细胞成活率，可作为研究NTDs治疗的方法之一，同时也为其他神经系统损伤进行干细胞移植治疗提供研究方向。现将经验总结如下。

3.1 显微手术技巧 手术时间的长短直接影响到胚胎的成活率，因此本研究并没有采用以往先手术后缝线的常规操作，而是预先在手术部位做一个缝线荷包，使手术时间大大缩短，一只胎鼠手术用时仅为2～3 min。手术过程中子宫壁开口大小是胚胎是否会被挤出的关键，我们的体会是开口不要超过5 mm。另外本研究注射干细胞前仅将子宫壁打开，并没有直接刺破羊膜，一定程度上缩短了在准备干细胞注射过程中胚胎暴露于空气中的时间，同时降低了子宫壁收缩压力过大导致胚胎被挤出的风险，亦是提高胎鼠成活率的重要手段。

3.2 显微注射技巧 干细胞注射完毕后外溢是显微注射操作的一大难题，本研究对此操作进行了改良。首先，本研究采用单人吹吸显微注射法，优点为无双人操作是否配合默契的问题；可根据自身呼吸控制注射针内压力，从而控制干细胞的注入速度，也可以轻松控制细胞流速与退针的速度。其次，进针后保持2 s及退针后针尖在组织内保持2 s的做法，使干细胞外溢的可能性大大降低。脊髓本身厚度约为1.5 mm，皮肤及肌肉厚度约为1 mm，本研究保持进针深度约为2 mm，在这个深度注射干细胞能够确保干细胞成功注入脊髓。

3.3 术中与术后动物护理 由于体温调节中枢紊乱，动物麻醉后会发生低体温，极易导致死亡[16，17]。本研究使用了手术加热垫，保持动物体温在37～38 ℃。温湿中孔纱布温度也保持在37～38 ℃，能够维持子宫角温度；此外，术中不断向子宫角滴加预热温生理盐水，不仅可以避免子宫角暴露于空气中，也可以保持子宫所需的温度及湿度。为降低手术时间及胎鼠死亡率，本研究将每只孕鼠手术的胚胎数控制为3～5只，且间隔进行手术操作，保证从开腹到关腹时间控制在30 min以内。子宫回纳到腹腔后，轻轻挤压腹壁可以使子宫角及肠道回归原位，避免术后出现肠梗阻。

本研究中胎龄16、17、18天的脊椎裂胎鼠干细胞移植后成活率分别为72.1%、77.3%、87.0%，为干细胞移植治疗先天性显性脊椎裂的最佳时机提供依据。本研究总的胎鼠成活率仅为76.7%，说明该技术仍存在很大的提升空间。

总之，采用显微注射、显微外科和胎仔外科技术对脊椎裂胎鼠进行干细胞移植治疗的成功率较高。关于干细胞移植治疗先天性显性脊椎裂的疗效及其机制仍需进一步研究。

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A new method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida

ZHAOGuifeng,LIUBo,MIAOJianing,WUDi,LIHui,HUANGTianchu,YUANZhengwei

(ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shengyang110004,China)

Objective To establish a novel method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida. Methods Thirty pregnant female rats (16 days, E16), 30 pregnant female rats (17 days, E17) and 26 pregnant female rats (18 days, E18) were selected to establish the animal models of congenital dominant spine bifida. The bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) transfected with green fluorescent protein (GFP) gene were subsequently transplanted into spinal cord of pregnant rats with congenital dominant spine bifida by fetal surgery, microsurgery and microinjection. The E20 pregnant rats were killed and embryo biopsy was performed to count fetal rat survival rate. The spinal cord stem cell transplantation in fetal rat was observed under the fluorescence microscope. Results The survival rate was 94.2% (81/86) for E20 pregnant rats receiving surgery. One hundred ninety-eight embryo rats with stem cell transplantation survived in 258 rats with congenital spinal bifida fetal, whose survival rate was 76.7% (198/258). The survival rates were 72.1% (80/111), 77.3% (78/101) and 87.0% (40/46) in E16, E17, and E18 fetal rates receiving stem cell transplantation. The GFP was observed in embryo spinal cord under fluorescence microscopy. The survival rate of MSCs was 98.5% (195/198). Conclusions We successfully establish an new method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida and its stem cell survival rate is high. This method can be used as one of the methods in treatment of neural tube defects.

congenital dominant spine bifida; embryo; microsurgery; microinjection; bone marrow mesenchymal stem cells; transplantation; rats

国家自然科学基金资助项目(81171072)。

赵桂锋(1983-)，男，助理实验师，研究方向为动物显微手术。E-mail： animal_lab@yeah.net

袁正伟(1964-)，男，教授，研究方向为小儿先天畸形。E-mail： yuanzw@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.003

R682.1

A

1002-266X(2016)16-0008-03

2015-11-12)