早发重度PE及HEELP综合征患者胎盘组织、母血、脐血中HMGB1和RAGP的表达观察

李红，闫欢，朱琳琳,2，王晓芳，王金铭，冷茂东,张展

(1郑州大学第三附属医院，郑州 450052；2新乡医学院)

早发重度PE及HEELP综合征患者胎盘组织、母血、脐血中HMGB1和RAGP的表达观察

李红1，闫欢1，朱琳琳1,2，王晓芳1，王金铭1，冷茂东1,张展1

(1郑州大学第三附属医院，郑州 450052；2新乡医学院)

目的 观察早发重度子痫前期(PE)及HELLP综合征患者胎盘组织、母血、脐血中高迁移率族蛋白1(HMGB1)和晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达变化，探讨其与早发重度PE及HELLP综合征发病的关系。方法 30 例早发重度PE患者(早发重度PE组)、12例HELLP综合征患者(HELLP组)、30例正常孕妇(对照组)，分别采用免疫组化法、Western blotting法对三组胎盘组织中的HMGB1蛋白和RAGE蛋白进行定位及定量检测，采用实时定量PCR法对三组胎盘组织中HMGB1 mRNA和RAGE mRNA进行检测，采用ELISA对三组母血、脐血中的HMGB1蛋白和RAGE蛋白进行检测。结果 对照组胎盘组织中仅有极少量HMGB1阳性合体滋养细胞，早发重度PE组HMGB1阳性细胞主要为合体滋养细胞和血管内皮细胞且阳性细胞数量明显增多，HELLP组HMGB1阳性细胞主要为合体滋养细胞、单核巨噬细胞、血管内皮细胞；对照组胎盘组织可见少量RAGE阳性合体滋养细胞、血管内皮细胞，早发重度PE组RAGE阳性细胞分布与对照组一致，HELLP组RAGE阳性细胞主要为合体滋养细胞、单核巨噬细胞(阳性细胞数量和表达强度均明显高于早发重度PE组)。早发重度PE组和HELLP组胎盘组织中HMGB1、RAGE的蛋白及mRNA表达明显高于对照组(P均<0.05)，且HELLP组高于早发重度PE组(P均<0.05)。早发重度PE组和HELLP组母血HMGB1、RAGE蛋白水平明显高于对照组(P均<0.05)，且HELLP组高于早发重度PE组(P均<0.05)。三组脐血HMGB1、RAGE蛋白水平相比,P均>0.05。结论 HMGB1、RAGE在早发重度PE及HELLP综合征患者胎盘组织及母血中的表达明显升高，二者可能共同参与了早发重度PE及HELLP综合征的发生发展过程。

子痫前期；HELLP综合征；高迁移率族蛋白1；晚期糖基化终末产物受体

重度子痫前期(PE)是一种常见的妊娠期高血压疾病，多发生于妊娠20 周以后[1]。HELLP综合征是妊娠期高血压疾病的一种严重并发症，多继发于重度PE。近年来，重度PE与炎症的关系越来越受到重视。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种独立的晚期炎性介质[2]，与细胞膜表面晚期糖基化终末产物受体(RAGE)结合后可激活细胞内信号传导通路，引发一系列病理损伤，参与多种全身和局部炎性疾病的发病过程。正常妊娠即存在轻度炎性反应。有研究[3]结果提示过度炎症反应导致机体的一系列损伤反应是引发PE的重要因素。有关HMGB1、RAGE与早发重度PE及其并发症HELLP综合征的关系尚不明确。本研究对早发重度PE及HELLP综合征患者胎盘组织、母血、脐血中HMGB1和RAGE的表达变化进行了观察，探讨其与早发重度PE及HELLP综合征发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年12月～2015年12月就诊于郑州大学第三附属医院的早发重度PE患者30例(早发重度PE组)、HELLP综合征患者12例(HELLP组)，同期选择正常足月孕妇30例(对照组)作对照。早发重度PE组年龄(29.3±1.6)岁、采血孕周(30.7±2.6)周、分娩孕周(31.7±2.5)周、BMI(31.4±0.9)kg/m2；HELLP组年龄(30.2±1.9)岁、采血孕周(31.6±3.0)周、分娩孕周(32.7±2.4)周、BMI(31.5±1.1)kg/m2；对照组年龄(30.6±2.1)岁、采血孕周(29.6±2.2)周、分娩孕周(38.8±2.7)周、BMI(30.1±1.2)kg/m2；三组年龄、采血孕周、分娩孕周、BMI有可比性(P均>0.05)。三组均为自然受孕、单胎妊娠、剖宫产分娩、初产妇，均无原发性慢性高血压病、肝肾疾病及其他合并症。

1.2 标本采集及处理 ①胎盘组织：胎盘娩出后立即以脐带为中心于胎盘母体面3 、6 、9 、12 点和中央区(避开钙化区)各取1 cm×1 cm×1 cm的组织1 块,生理盐水清洗后分3份，其中 1 份4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，供免疫组化染色用；其余2份置入冻存管封存后立即投入液氮中保存，供Western blotting及实时定量 PCR 检测用。②母血：空腹采集肘静脉血5 mL，置入含促凝剂和分离胶的试管，2 500 r/min离心15 min，取血清，-80 ℃冰箱中保存备检。③脐血：胎儿娩出后、胎盘娩出前留取脐静脉血5 mL，处理方法同母血。

1.3 胎盘组织HMGB1、RAGE检测 ①HMGB1、RAGE蛋白定位检测：受检胎盘组织标本用免疫组化SP法染色，DAB显色试剂显色，苏木素复染，脱水，封片，显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照。每张切片400倍显微镜下随机选取5个视野,每个视野计数100个细胞，计算5个视野阳性细胞百分数，即为该切片阳性细胞百分数：无阳性细胞计0分，阳性细胞≤10%计1分、11%～50%计2分、51%～75%计3分、>75%计4分；细胞无着色计0分、浅黄色计1分、黄色或深黄色计2分、褐色或棕褐色计3分；上述两项得分之积<3为阴性、≥3为阳性。②HMGB1、RAGE蛋白定量检测：采用Western blotting法。将受检胎盘组织置EP管，加300 μL裂解液和3 μL蛋白酶抑制剂，匀浆、离心后提取蛋白，BCA 定量试剂测定蛋白浓度，蛋白上样量为40 μg，体系为25 μL。配制8%聚丙烯酰胺凝胶，加样后电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭、一抗 4 ℃孵育过夜，洗膜30 min，加荧光素标记的二抗。用ODYSSEYClx检测与成像系统对条带的灰度进行扫描、分析。以目的蛋白条带与内参条带的灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量。③HMGB1、RAGE mRNA检测：采用实时定量PCR法。用TRIzol 提取受检胎盘组织总RNA，根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录。PCR反应体系：cDNA模板0.8 μL，2×Ultra SYBR Mixture10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，去RNase水8.4 μL，总体积20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共35个变性/退火循环，72 ℃ 延伸10 min。所有反应设复孔，所有PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳证实为特异性条带。PCR反应结束后，记录荧光信号达到设定阈值所经历的反应循环数(Ct值)，以2-ΔΔCt表示HMGB1、RAGE的mRNA相对表达量。实时定量PCR引物由北京华大基因公司设计合成，HMGB1上游引物为 5′-TGAGCTCCATAGAGACAGCG-3′，下游引物为 5′-GCAGACATGGTCTTCCACCT-3′，扩增产物248 bp；RAGE上游引物为5′-GCTGTCAGCATCAGCATCAT-3′，下游引物为5′-ATTCAGTTCTGCACGCTCCT-3′，扩增产物225 bp；内参基因β-actin上游引物为5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物为5′-CTCGGCCACATTGTGAACTTTG-3'，扩增产物198 bp。

1.4 母血、脐血中HMGB1蛋白和RAGE蛋白的检测 采用ELISA法，按试剂盒说明书操作。在450 nm处测光密度(OD)值，以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算母血、脐血中HMGB1蛋白和RAGE蛋白表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。多个独立样本均数比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t检验；率的比较用χ2检验；相关性分析用Pearson相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组胎盘组织HMGB1、RAGE蛋白定位检测结果比较 对照组胎盘组织中仅有极少量HMGB1阳性细胞，主要为合体滋养细胞，呈弥漫性分布、浅黄色；早发重度PE组HMGB1阳性细胞主要为合体滋养细胞和血管内皮细胞，阳性细胞数量明显增多，染色强度也明显增强；HELLP组HMGB1阳性细胞主要为合体滋养细胞、单核巨噬细胞、血管内皮细胞，呈褐色或棕褐色。对照组胎盘组织可见少量RAGE阳性细胞，主要为合体滋养细胞、血管内皮细胞；早发重度PE组RAGE阳性细胞分布与对照组一致，但染色强度明显增强；HELLP组RAGE阳性细胞主要为合体滋养细胞、单核巨噬细胞，且阳性细胞数量和表达强度均明显高于早发重度PE组，呈棕褐色。

对照组、早发重度PE组、HELLP组的HMGB1蛋白阳性表达率分别为20.00%、66.67%、83.33%，RAGE蛋白阳性表达率分别为16.66%、66.67%、91.67%；早发重度PE组和HELLP组的HMGB1、RAGE蛋白阳性表达率与对照组相比，P均<0.05；HELLP组与早发重度PE组HMGB1、RAGE蛋白阳性表达率相比，P均<0.05。

2.2 三组胎盘组织HMGB1、RAGE蛋白定量检测结果比较 对照组、早发重度PE组、HELLP组胎盘组织HMGB1蛋白相对表达量分别为0.24±0.05、0.41±0.21、0.92±0.21，RAGE蛋白相对表达量分别为0.54±0.12、0.87±0.18、1.27±0.31；早发重度PE组、HELLP组与对照组相比，P均<0.05；HELLP组与早发重度PE组相比，P均<0.05。

2.3 三组胎盘组织HMGB1、RAGE的mRNA检测结果比较 对照组、早发重度PE组、HELLP组HMGB1 mRNA相对表达量分别为0.72±0.06、1.35±0.32、1.69±0.42，RAGE mRNA相对表达量分别为0.91±0.14、1.53±0.34、1.91±0.42；早发重度PE组、HELLP组与对照组相比，P均<0.05；HELLP组与早发重度PE组相比，P均<0.05。

2.4 三组母血、脐血中HMGB1蛋白和RAGE蛋白检测结果比较 对照组、早发重度PE组、HELLP组母血HMGB1蛋白水平分别为(8.31±0.37)、(12.08±1.55)、(18.31±1.91)ng/mL，RAGE蛋白水平分别为(17.17±1.02)、(26.55±4.18)、(35.78±5.21)ng/mL；早发重度PE组、HELLP组与对照组相比，P均<0.05；HELLP组与早发重度PE组相比，P均<0.05。

对照组、早发重度PE组、HELLP组脐血HMGB1蛋白水平分别为(2.24±0.15)、(2.41±0.24)、(2.43±0.26)ng/mL，RAGE蛋白水平分别为(4.15±0.33)、(4.62±0.43)、(5.01±0.60)ng/mL；三组间两两比较，P均>0.05。

2.5 早发重度PE组、HELLP组母血HMGB1蛋白与RAGE蛋白水平的相关性 早发重度PE组、HELLP组母血HMGB1蛋白与RAGE蛋白水平均呈正相关，r分别为0.820、0.840，P均<0.05。

3 讨论

HMGB1是一类广泛存在于真核细胞内的非组核蛋白，可通过免疫细胞分泌和坏死细胞释放两种途径转移至细胞外，其发生变化较晚、持续时间较长，是一种独立的晚期炎性介质[4]。文献[5,6]报道，PE患者胎盘组织中HMGB1蛋白及 mRNA高表达。本研究发现，对照组胎盘组织中无或仅有极少量HMGB1蛋白阳性细胞，主要为合体滋养细胞，呈弥漫性分布、浅黄色；早发重度PE组HMGB1蛋白阳性细胞主要为合体滋养细胞和血管内皮细胞，染色强度明显增强；HELLP组HMGB1蛋白阳性细胞主要为合体滋养细胞、单核巨噬细胞、血管内皮细胞，呈褐色或棕褐色染色；早发重度PE组和HELLP组的HMGB1蛋白阳性表达率明显高于对照组，HELLP组高于早发重度PE组；早发重度PE组和HELLP组的HMGB1 mRNA表达量也明显高于对照组，HELLP组高于早发重度PE组；这与Pradervand等[7]的研究结果一致。考虑合体滋养细胞、单核巨噬细胞及血管内皮细胞是HMGB1蛋白的主要靶细胞，过度炎症刺激可诱导单核巨噬细胞、血管内皮细胞、合体滋养细胞表达HMGB1和其他炎症因子，引起机体局限性和系统性的炎性病变。本研究结果还证实，早发重度PE组及HELLP组胎盘组织局部分泌并释放HMGB1是HMGB1的重要来源。另外，本研究发现早发重度PE组及HELLP组母血HMGB1蛋白水平明显高于对照组，且HELLP组显著高于早发重度PE组，考虑可能是早发重度PE患者在发病初期由于炎症刺激等原因直接导致滋养细胞及单核巨噬细胞损伤坏死，HMGB1释放入血，引起母血中HMGB1蛋白水平升高。HMGB1将可能成为早发重度PE及HELLP综合征的早期预测指标。

RAGE是细胞表面免疫球蛋白超家族中的一种多配体受体，主要分布于单核巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞等细胞表面。在不同的疾病状态下，RAGE可以结合不同的配体，包括HMGB1、钙粒蛋白S100、晚期糖基化终产物蛋白AGE等[8]。正常生理状态时，RAGE的mRNA和蛋白呈低水平表达，然而在多种炎性疾病状态下RAGE的配体大量堆积，上调RAGE的表达并与其结合，导致组织细胞的损害。Holmlund等[9]认为与健康对照组比较，PE患者胎盘组织中RAGE表达并无明显变化；但Oliver等[10]的研究却显示，PE患者胎盘组织中RAGE的表达水平比正常组孕妇明显升高。本研究发现，RAGE的 mRNA和蛋白在早发PE组及HELLP组胎盘组织中均高于对照组，且HELLP组表达水平高于早发重度PE组；对照组胎盘组织可见少量RAGE蛋白阳性细胞，主要为合体滋养细胞、血管内皮细胞；早发重度PE组RAGE蛋白阳性细胞分布与对照组一致，但染色强度明显增强；HELLP组RAGE蛋白阳性细胞主要为合体滋养细胞、单核巨噬细胞，阳性细胞数量和表达强度均明显高于早发重度PE组；早发重度PE组和HELLP组的RAGE蛋白阳性表达率明显高于对照组，HELLP组高于早发重度PE组；早发重度PE组和HELLP组的RAGE mRNA表达量也明显高于对照组，HELLP组高于早发重度PE组。这与Zhu等[6]的研究结果相符。分析可能是早发重度PE患者在发病初期，RAGE的配体HMGB1大量堆积，通过受体依赖的方式上调RAGE的表达，导致促炎症细胞因子的作用增强，继而侵犯滋养细胞，使合体滋养层细胞及单核巨噬细胞中的RAGE表达上调；同时早发重度PE发生时，炎性损伤刺激免疫细胞分泌的HMGB1入血，RAGE与其配体HMGB1结合，激活细胞内信号传导途径，诱导氧化应激和炎性损伤反应，又可进一步导致细胞坏死，这种正反馈效应导致HMGB1、RAGE的作用被放大，加重了靶组织的损伤，继而导致HELLP综合征的发生、发展。本研究结果还显示，早发重度PE组、HELLP组母血RAGE蛋白水平明显高于正常对照组，且其HMGB1蛋白水平与RAGE蛋白水平呈正相关，提示早期联合检测母血HMGB1、RAGE蛋白可以预测早发重度PE及HELLP综合征；三组脐血中HMGB1、RAGE蛋白水平差异无统计学意义，可能是由于胎盘屏障的保护作用，早发重度PE及HELLP综合征未造成胎儿血管内皮细胞的损伤，这需要进一步扩大样本量进行验证。

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Expression of HMGB1 and RAGE in placenta, maternal serum and cord serum in patients with early-onset severe PE and HELLP syndrome

LIHong1,YANHuan,ZHULinlin,WANGXiaofang,WANGJinming,LENGMaodong,ZHANGZhan

(1TheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To observe the expression changes of high mobility group box 1 (HMGB1) and receptor for advanced g1ycation end products (RAGE) in the placenta, maternal serum and cord serum in patients with early-onset severe preeclampsia (PE) and HELLP syndrome, and to analyze the correlation of HMGB1 and RAGE with the pathogenesis of early-onset severe PE and HELLP syndrome. Methods Thirty patients with early-onset severe preeclampsia (early-onset severe PE group), 12 patients with HELLP syndrome (HELLP group) and 30 healthy pregnant women (control group) were recruited in the study. Immunohistochemistry and Western blotting were used to investigate the locations and expression of HMGB1 and RAGE protein in the placentas. Real-time PCR was used to investigate the expression of HMGB1 and RAGE mRNA in the placentas. ELISA was further used to detect the levels of HMGB1 and RAGE protein in maternal and cord serums of the three groups. Results A low level of positive immunostaining for HMGB1 was observed in syncytiotrophoblast cells in placentas of control group, the level was significantly increased in syncytiotrophoblast and vascular endothelial cells in placentas of early-onset severe PE group, besides, in the placentas of HELLP group, positive HMGB1 cells were mainly syncytiotrophoblast, macrophage and vascular endothelial cells. A small amount of positive immunostaining for RAGE was observed in syncytiotrophoblast and vascular endothelial cells in placentas of the control group, the distribution of positive cells in placentas of the early-onset severe PE group was consistent with that of the control group, what's more, in the placentas of HELLP group, the positive RAGE cells were mainly syncytiotrophoblast and macrophage cells (immunoreactive cells and the expression intensity were significantly higher than those in the early-onset of severe PE group). Compared with the control group, the protein and mRNA levels of HMGB1 and RAGE were increased in the placentas of early-onset PE and HELLP groups, furthermore, the levels of them in HELLP group were even higher than those in the early-onset severe PE group (allP<0.05). In addition, the levels of HMGB1 and RAGE in the maternal serum of early-onset severe PE and HELLP groups were higher than those of the control group, besides, the levels of them in the HELLP group were even higher than those in the early-onset severe PE group (allP<0.05). However, there were no statistically significant differences in the levels of HMGB1 and RAGE in the cord serum among the three groups (allP>0.05). Conclusion The levels of HMGB1 and RAGE protein increase significantly in the maternal and cord serums of patients with early-onset severe PE and HELLP syndrome, both of which may participate the occurrence and development of early-onset severe PE and HELLP syndrome.

preeclampsia; HELLP syndrome; high mobility group box 1; receptor for advanced glycation end products

河南省高等学校重点研究项目(15A320064)。

李红(1976-)，女，硕士，主治医师，主要研究方向为围产医学。E-mail: 525444760@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.010

R714.25

A

1002-266X(2016)43-0034-04

2016-08-18)