高新技术疫苗研究的现状与发展趋势

尼 悦 （山东省烟台市饲料监察所　264003）　党安坤　（山东省动物疫病预防与控制中心）田召芳　王晓玲　（山东省烟台市动物疫病预防与控制中心）



高新技术疫苗研究的现状与发展趋势

尼 悦 （山东省烟台市饲料监察所264003）党安坤（山东省动物疫病预防与控制中心）
田召芳王晓玲（山东省烟台市动物疫病预防与控制中心）

随着分子生物学的发展高新技术疫苗已成为研究的前沿领域。目前，基因工程苗、合成肽疫苗、重组活载体疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因缺失苗、核酸疫苗等许多高新技术疫苗逐渐应用到疫苗生产中。以分子生物学技术的基本方法研究开发兽用新型疫苗是21世纪的主导方向，本文主要对高新技术疫苗研制过程中发挥的作用及存在问题做以综述。

随着生物技术的进步，分子生物学、分子免疫学等研究取得进展与基因工程技术的应用，疫苗的研究将会发生革命性变化，新一代的高新技术疫苗也将会大范围投放到市场。冯涛和冯秀丽（2001）也认为高新技术疫苗将会很有市场，因为不仅能改善机体的免疫应答和免疫保护，而且为有效地预防和控制新的传染病提供了新途径［1］。

1　高新技术疫苗研究现状

1.1基因工程疫苗基因工程苗是使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。基因工程疫苗具有广泛的应用前景，不仅能够预防疾病的发生而且能够有效治疗一些疾病。例如，向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。

1.2重组活载体疫苗重组活载体疫苗是将编码病原体的有效免疫原的基因插入载体基因组中，接种后疫苗株在体内增殖使大量所需的抗原得以表达。重组活载体疫苗的载体可以选择细菌和病毒。病毒载体的优点是产生外源蛋白接近翻译后水平的成熟蛋白质。细菌载体的优点是能表达多种不同的外源抗原。所有理想活载体具有安全、有效、免疫应答等效用，提高重组载体活疫苗的免疫能力［2、3］。 蒋桃珍和宁宜宝（2000）认为活载体疫苗可同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，可一针防多病［4］。例如以鸡痘病毒为载体的鸡马立克氏病+鸡新城疫+鸡痘三联疫苗等，既能降低生产成本又能简化免疫程序，还能克服不同病毒弱毒疫苗间产生的干扰现象。

1.3基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗。陆承平（2001）用基因工程DNA重组技术将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达基因产物—蛋白质或多肽制成疫苗［5］。该疫苗与传统疫苗相比较具有安全性高、纯度高，稳定性好以及产量高等优点而且SVDV已经对引起中和抗体产生的衣壳蛋白VP1、VP2进行了表达（周鹏程等，1998；周永国，2003），可望将来不就问世［5］。

1.4基因缺失疫苗基因缺失疫苗是指缺失主要毒力基因（TK）和非必须糖蛋白基因（gG和gE），使临床上实现区分自然感染野毒和疫苗免疫成为可能。基因工程缺失疫苗是利用基因工程技术在基因组中插入活缺失一段序列致使某些基因不能够表达，从而使致弱病毒同时又保持其较强的免疫原性，而其中缺失的主要是其毒力基因胸苷激酶（TK），蛋白激酶（PK），核酸还原酶（RR）和脱氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase）以及一些具有免疫原性的糖蛋白gG、gE、gC、gD等。目前据此已构建了许多种单基因、双基因及多基因缺失疫苗。

1.5核酸疫苗核酸疫苗是指将含有编码的蛋白基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法将外源基因注入宿主细胞，从而使外源基因在肌肉细胞内表达、加工为成熟多肽，成熟多肽与宿主MHCⅠ和MHCⅡ类结合，再将抗原决定簇提呈给免疫相关细胞，因此，核酸疫苗可产生广谱的免疫应答，诱导机体产生抗体、辅助性T细胞（Th）、细胞毒T细胞（Tc）。核酸疫苗在构建时可根据需要选择Th 1或Th 2应答。Th 1亚群分泌的细胞因子诱导产生IgG2a和促进产生细胞介导的免疫应答，Th2亚群所分泌的细胞因子主要促进产生IgG，诱导体液免疫。Raz等（1994）将含NP基因的质粒皮下接种小鼠后，采集接种部位组织免疫组化法细胞染色，发现阳性细胞有角质化细胞、成纤维细胞、树突状细胞，说明这些细胞在免疫应答中的作用。在肌肉细胞中也发现树突状细胞，但尚无其抗原提呈的证据［7］。

1.6合成肽疫苗合成肽疫苗是一种仅含免疫决定簇组分的小肽，即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽，与载体连接后加佐剂所制成的疫苗，是最为理想的安全新型疫苗。合成肽疫苗分子是由多个B细胞抗原表位和T细胞抗原表位共同组成的，大多需与一个载体骨架分子相耦联。合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒（FMDV）合成肽疫苗，主要集中在FMDV的单独B细胞抗原表位（VPI环）或与T细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究。虽然取得了一定的进展，但仍未获得一种具有理想保护作用的合成肽疫苗。姜平（2003）报导，其特点是纯度高、稳定。在动物病原方面，研究较为成熟的是合成口蹄疫病毒（FMDV）VPl的第141～160位氨基酸片段，将其连接在不同辅助T细胞（Th）表位上，在猪体内有较好的保护效果［8］。这种合成肽是利用B细胞与猪体能识别的Th细胞表位相结合的原理合成的可以大大提高其免疫原性，并不需偶联到载体蛋白即可产生中和抗体。邢钊和张健（2000）报导，应用同一原理有可能发展合成其他多肽疫苗，也可用人工合成基因（含B细胞，Th细胞和Tc细胞表位）来表达比天然抗原更强的人工抗原，这在肿瘤疫苗和寄生虫疫苗的研究开发中可能有特别重要的意义［9］。

1.7抗独特型抗体疫苗抗独特型抗体疫苗是20世纪70年代后期发展起来的一种新型免疫生物制剂。该疫苗是以抗病原微生物的抗体（Ab1）作为抗原来免疫动物，抗体的独特型决定簇可刺激机体产生抗独特型抗体（简称抗Id抗体，或Ab2），抗独特型抗体是始动抗原的内影像，可刺激机体产生对始动抗原的免疫应答，从而产生保护作用。根据Schick等人的报道，不仅β型抗独特型抗体可以替代抗原有效的激发动物的免疫反应，α型抗独特型抗体也有相似的作用［10］。而李保全，彭军等对抗H9亚型AIV独特型的单克隆抗体和多克隆抗体疫苗进行了研究，为现有的防治低致病性禽流感的方法作了补充，特别是为防制危害严重的高致病性禽流感提供参考［11］。

1.8病毒—抗体复合物疫苗病毒-抗体复合物疫苗又称免疫复合物疫苗，是一种新兴疫苗［12］。由特异性高免血清（抗体）按照恰当的比例与抗体（如传染性病毒）混合而成。目前此项技术已成功用于鸡传染性法氏囊病，新城疫的免疫同时对呼肠孤病毒也进行了类似实验［13］。

2　高新技术疫苗有待解决的问题

高新技术在疫苗生产中广泛应用，显示出了新技术疫苗的巨大潜力和应用前景。但是由于其发展时间有限所以仍存在很多的不足，想要真正应用到实际生产当中需要高度敏感的PCR技术等确证所注射的DNA疫苗的安全性，还需要长期的临床试验以明确其毒副作用和免疫效果［14］。

2.1安全性问题高新技术疫苗与传统疫苗相比同样存在安全性问题。虽然目前也未发现插入突变的证据，但不能完全排除少数质粒DNA插入到染色体上引起突变的可能性［15］。一旦整合到基因组中就可能使细胞癌基因激活或抑癌基因失活。

2.2保护效率问题目前为止，基因疫苗的免疫效率很难达到百分之百的免疫保护，且存在明显的种属个体差异，这可能与不同动物细胞需要不同启动子、抗原基因、给药方法途径、给药量有关［17］。

2.3免疫耐受问题基因疫苗体内持续表达产生抗原蛋白，可能打破机体本身的免疫平衡，引发免疫耐受。

3　高新技术疫苗未来发展趋势

（1）高新技术疫苗作为第3代疫苗，尤其在人类尚未攻克的疑难病症的预防和治疗方面显示出了良好的应用前景。大量的临床实验发现，试验动物并没有出现令人担忧的不良症状。目前，高新技术疫苗面临的主要问题是有时其引发的体液和细胞免疫达不到理想的状态和人们对其安全性的担忧［18］。因此在提高高新技术疫苗免疫效果的同时还需运用高效灵敏的检测技术进行长期的安全性评价。（2）由于传统疫苗的法规并不完全适用于高新技术疫苗，涉及到高新技术疫苗安全性的诸多因素还处于研究探索阶段，从疫苗设计、工程菌的选择、生产工艺、质量检验、使用剂量、免疫途径到免疫程序都没有相应的标准和成型的法规［19］。此外，在高新技术核酸疫苗设计上可运用生物信息学合成安全有效的真核表达质粒骨架；选用无抗生素抗性的选择标签，如营养缺陷型和平衡致死系统选择标志既可保证质粒的稳定表达，又可消除因抗性基因引发的疫苗安全性问题；尽可能选择宿主范围窄的质粒复制功能区和缩小质粒也是增加安全性的方法之一，还可采取生物遏制的方法在保证质粒稳定复制的情况下抑制工程菌的过量增殖，以减少细菌内毒素对机体的伤害；或是选用食品级的工程菌如乳酸乳球菌来增加疫苗的安全性［20］。尤其要在适当的动物模型中进行细致的临床前研究，积累大量的实验数据，为高新技术疫苗法规的早日成型奠定基础。

参考文献

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［5］ 陆承平. 兽医微生物学第3版［M］. 北京∶中国农业出版社， ， 2001，192-193.

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中图分类号：S859.79+7

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2016）06-0061-03

收稿日期：（2016-04-25）