从生物学角度认识小分子药理作用机制＊——中药小分子研究的思路

王玉刚，谢伟东，雷 帆，王欣佩，杜力军，邢东明＊＊

（1.清华大学生命科学学院药物药理实验室 北京 100084；2.美国德州大学MD Anderson 癌症研究中心休斯顿 77030；3.清华大学深圳研究生院生命与健康学部 深圳 518055）

从生物学角度认识小分子药理作用机制＊
——中药小分子研究的思路

王玉刚1，2，谢伟东3，雷 帆2，王欣佩2，杜力军2，邢东明2＊＊

（1.清华大学生命科学学院药物药理实验室 北京 100084；2.美国德州大学MD Anderson 癌症研究中心休斯顿 77030；3.清华大学深圳研究生院生命与健康学部 深圳 518055）

中药小分子是一类从天然产物中分离得到的具有特定生物活性的小分子化合物。按照现代药物发现类型的划分标准，中药小分子的发现主要依靠药效筛选。基于化合物的药学特性，构建和优化高精度、高通量新型药物筛选系统，需要研究人员不断将新的生物学技术和理念应用于中药小分子药理作用机制的准确认识。本综述将重点讨论小分子药理机制研究中对药物作用靶点的认识，为中药小分子研究思路提供借鉴。同时，本文还介绍了一些利用前沿生物学技术研究小分子药理的实例，最后讨论小分子药理机制研究对现代药物发现的意义。

中药小分子 生物学 药理机制

在对病理机制的理解和药物发现过程中，基础医学对疾病的研究和认识与分子药理学发展的联系日渐紧密。新方法和新技术促进基础医学研究的发展，基础医学新发现为药物研发提供了新思路、新方向。同时，药物发现过程对这些新靶点和新机制进行了验证或者证伪，并为基础医学研究提供了新的命题。对药物靶点的认识直接决定药物机理研究的内容和深度。

传统的药物靶点是指与药物与生物体系相互作用并产生药理活性的具体生物分子。这一概念建立在物理性相互作用基础上，在实际的大多数小分子药物的作用机理中，并不能得到很好的理解。小分子药物在生物体系内的相互作用分子远不止一种，如小檗碱[1]，喜树碱[2]等。实验证明大多数小分子药物的生物活性会根据生物体系所处的生理状态而表现出多样性。因此，根据研究和应用的需要，药物作用靶点概念定义的对象可以灵活拓展到细胞、组织、器官，甚至整个生物体系。将药物靶点定义的先决条件设定为：药物在一个特定的时间点或者特定生理状态下表现出一个或一系列特定的生物学活性。本文将通过综述目前应用成熟的小分子药理机制研究手段，从生物学角度对小分子尤其是中药小分子药理作用的研究进行讨论。

1 小分子药理研究方法

目前，药物的作用靶点及作用机制研究常用的方法如下：

1.1 亲和性分析法

生物体系内与药物相互作用的生物大分子是人们对药物作用靶点的最直观的理解，因此小分子药物和生物大分子之间的亲和性分析是找到药物作用靶点最直接的思路和方法。早期的小分子药物作用靶点研究主要通过化学修饰的方法把小分子化合物与分子标签连接，将带有分子标签的小分子作为固定相去“抓取”生物样品中能够与特定小分子化合物相互作用的蛋白，然后通过蛋白质化学的方法对“抓取”到的蛋白进行定性分析[3]。然而，这种方法有两个主要弊端：①该方法破坏了细胞结构，忽略了小分子药物在细胞内可能存在的分布规律，因此容易出现“抓取”的生物大分子在实际过程中无法和药物“相遇”，例如不能进入细胞的药物就不能“抓取”到细胞内生物大分子，不能进入线粒体的药物就不能“抓取”到线粒体内蛋白等；②该方法简单地将活细胞变成了一个无活性的生物大分子库，忽略了药物活性对细胞生理状态的依赖性，因此容易出现“抓取”的生物大分子和特定的生物学活性不对应，或者是根本无法“抓取”相互作用的生物大分子。

为克服上述问题，目前比较成熟的方法是在分子标签与小分子连接后，将标记的小分子直接给药到生物体中，在获得药效数据的同时固定生物样品，通过“抓取”有标签小分子与靶点结合形成的复合体，来研究药物的作用靶点。该方法能捕捉小分子与生物体内大分子靶点相互作用的产物，精确找到特定生理状态下小分子的作用靶点。然而，由于标签在小分子结构上的占位效应可能干扰其与靶点的相互作用，或引起细胞通透性和代谢属性发生变化，该方法所适用的小分子药物靶点和机制研究范围有一定的局限[4]。

并且，因小分子药物对生物大分子产生作用的前提是小分子的浓度需足够引起生物大分子产生后续生化信号[1]，当小分子药物和生物大分子相遇后，能否达到有效作用浓度以及给药后何时达到有效作用浓度是药物作用机制研究的另一重要内容，直接关系到小分子药物在特定生理条件下的生物活性。

1.2 基因表达谱分析法

基因表达谱的改变是生物体系对药物反应的重要组成部分，得益于基因表达调控机制研究积累的大量数据和类型众多的基因表达谱、蛋白表达谱、miRNA表达谱等组学研究，可以通过比较基因表达谱的差异缩小药物作用靶点的寻找范围，结合大数据技术分析药物作用机制，通过实验方法最终确定药物的作用靶点和机制。这种方法需要大量的资金投入和强大的数据分析团队支持，一般比较适用于大型研究团队在结构类似物筛选中得到的先导化合物的研究。例如Boitano通过比较StemRegenin（SR1）与其无药理活性结构类似物处理细胞后基因表达谱的差异发现了CYP1B1与AHRR的表达变化，分析发现了调控CYP1B1与AHRR表达的转录因子AHR是SR1的作用靶点，确定了SR1的药理作用机制[5]。

同时，基因表达谱的改变实时地对应着生物体的生理状态，通过大数据分析同一个小分子药物在不同基因表达谱背景下所产生不同的生物学活性，有助于在众多生物大分子中找到与小分子药物特定活性直接相关的候选分子，进而推进小分子药物作用靶点和作用机制的确定，例如Germain通过发现FADS2在乳腺癌细胞内表达水平与ML239药效相关性确定了ML239治疗乳腺癌的作用靶点和药理机制[6]。

1.3 测序分析法

快速经济的测序手段的升级为抗药性机制的研究提供了平台。生物在自然界中通过不断地基因突变而获得适应生存环境压力的生物学特性，这种现象在药物应用领域中体现得最多的是生物体对药物抗性的获得。抗药性突变的确定是药物作用靶点和作用机制的研究中非常有效的思路和方法，该药物作用机制研究方法大多数情况下被应用于抗菌药的机制研究。如Howe团队为了找到Ribocil抑制大肠杆菌核黄素生成的机制，通过全基因组测序在Ribocil抗性突变株中找到了ribB基因上的特定突变位点，进而利用结构生物学方法分析Ribocil与ribB基因表达产物的共结晶结构，找到了Ribocil的作用靶点和作用机制[7]。但由于抗性突变获得的偶然性，这种研究路线的可控性有待提高。

1.4 生物信息学分析法

信息学方法在生物医药领域的应用使小分子药物作用机理研究所产生的大量实验数据得到了很好的归纳和总结，并按不同的使用目的、研究对象、研究内容等建立了不同的数据库，由此形成相应的新学科，如网络药理学。利用大数据和计算机学习的方法对这些数据库进行分析，建立相关联的模型，提出可能的药物作用机制假设用于进一步的实验验证。这种方法可以缩小药物作用机制研究初始阶段的寻找范围，提高研究效率，对热点化合物的作用机理研究具有重要意义。如Seashore-Ludlow开发的多维集束分析方法，该方法在481个已知作用机制的小分子化合物分别处理664个肿瘤细胞系的数据库基础上，通过计算机比对分析归纳化合物已知的作用机制和细胞系生物学特性，构建分析数据库；将机制未知的化合物处理多个细胞系之后的实验数据在该分析数据库内比对后总结出该化合物的作用机制[8]。该类研究方法是目前网络药理学和系统药理学的核心思路。

2 小分子药理研究对后续药物开发的意义

精准的药理作用研究有利于构建高精确度的药物筛选体系。目前，药物筛选的主流方向是具有快速、高通量特点的基于靶点的筛选方法，其中以肿瘤特异性蛋白激酶抑制剂筛选最为成功。然而据统计，美国FDA在1998-2008年间批准的药物中，有56%的I类新药是通过药效筛选获得的，34%的I类新药是通过靶点筛选获得[9]。这说明在实际的药物研发过程中，许多基于靶点的药物筛选产生的I类新药没有通过美国FDA的审批，而传统的基于药效的低通量筛选在药物研发领域里仍然更胜一筹。其主要原因是，现在选择药物筛选靶点没有建立在准确的病理机制或药理机制的研究基础上。从整个药物研发领域的发展出发，精准的药理作用靶点研究是目前基于靶点药物筛选应用领域急需解决的问题，也是是精准药物筛选体系建立的必然需要。

对通过靶点筛选获得的药物，作用机理的精准研究有利于不断优化筛选方案，获得更好的特异性药物。由于生物体内生理条件的多样性、体内信号通路的复杂性，目前我们得到的病理机制或药理机制可能只是相关的级连通路，虽然把“刺激”输入生物体这个黑箱后输出的数据指标与人们设计的一致，但这并不代表人们一定找到了正确的靶标，如果靶点不精准就可能出现药物副作用等不可预测、不可控的问题，药物效价低[10]。精准的病理机制、药物作用机理研究有利于药物理化性质与作用靶点在时空分布和作用强度上的不断优化，最大程度上提高药物作用的特异性，降低副作用的不可控性，提高特定适应症治疗药物的研发效率。

对于基于药效筛选发现的药物而言，精准的药理机制研究可以找到准确的病理机制和药物作用的准确机理，这对确定最优化的靶点十分有利，进而可以促进药物性质的优化。另一方面，在已知的高效低毒的药理特性的基础上，对已有药物作用机理的药物进行精确的反向研究，有助于发现新的生物信号通路，以此找到针对特定适应症的治疗方案和药物筛选方案，促进基础医学的新发现和新药研发。此类研究有助于解释一些机制不明、疗效较好的经验药物适应症，及对应疾病的发病机理，对找到关键靶点、实现靶点选择和药物筛选方式的优化、找到针对同一适应症的高效药物十分有利。

3 小结

中药小分子药物在生物体系内的作用机制及作用靶点研究是现代药理学的重要组成部分。其主要目的是精确解释药物的作用机理，以此构建具有高精度、高通量、高效率的药物筛选系统，以促进药物的发现。生物技术的高速发展为药理学研究提供了更多样的技术手段，极大地促进了药理学的发展。在新技术的应用过程中，药物作用靶点的定义决定了药理机制研究的深度和广度。本文所介绍的生物技术在药理研究中的应用实例及药物作用靶点的相关讨论将有助于推动中药新药的研究。

1 Wang Y G, Kheir M M, Chai Y S, et al. Comprehensive study in the inhibitory effect of berberine on gene transcription, including TATA box. PLoS One, 2011, 6(8): e23495.

2 Carcia-Carbonero R, Supko J G. Current Perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clin Cancer Res, 2002, 8(3): 641-661.

3 Rix U, Superti-Furga G. Target profiling of small molecules by chemical proteomics. Nat Chem Biol, 2009, 5(9): 616-624.

4 Johnson K, Zhu S, Tremblay MS, et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science, 2012, 313: 1929-1935.

5 Boitano A E, Wang J, Romeo R, et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science, 2010, 329: 1345-1348.

6 Germain A R, Carmody L C, Morgan B, et al. Identification of aselective small molecule inhibitor of breast cancer stem cells. Bioorg Med Chem Lett, 2012, 22:3571-3574.

7 Howe J A, Wang H, Fischmann T O, et al. Selective smallmolecule inhibition of an RNA structural element. Nature, 2015, 526:672-677.

8 Seashore-Ludlow B, Rees M G, Cheah J H, et al. Harnessing connectivity in a large-scale small-molecule sensitivity dataset. Cancer Discov, 2015, 5: 1210-1223.

9 Swinney D C, Anthony J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov, 2011, 10(7):507-519.

10 Vincent F, Loria P, Pregel M, et al. Developing predictive assays: the phenotypic screening “rule of 3”. Sci Transi Med, 2015, 7(293):15.

Understanding of Pharmacological Mechanisms of Small Molecules from a Biological Standpoint—A Research Approach of Small Molecules from Extracts of Chinese Materia Medica

Wang Yugang1,2, Xie Weidong3, Lei Fan2, Wang Xinpei2, Du Lijun2, Xing Dongming2
(1.Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Science, School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084,China; 2.MD Anderson Cancer Center, Brain Tumor Center and Department of Neuro-Oncology, The University of Texas, Houston, 77030, USA; 3. Division of Life Science & Health, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China)

Small molecule drugs identified in traditional Chinese materia medica (TCM) were a class of small molecule compounds discovered in natural products, which were mostly discovered by efficacy-based drug screening process. Aiming to optimize the drug abilities of natural products-derivated small molecules and establish high throughput target-based drug screening system, the most advanced biotechnologies were adopted to decipher the drugs’ mechanism of actions (MOA), through which the targets and optimization strategies could be identified. As the importance of drug target in drug discovery process, the concept of the drug target in biological system was principally discussed in this review for better understanding of the small molecular mechanisms of Chinese materia medica. In addition, the instances of the undergoing MOA studies through advanced biotechnologies were also briefly introduced. Besides, in regard to the development of drug discovery, the significance of MOA studies was also discussed.

Small molecules of Chinese materia medica, biology, pharmacological mechanism

10.11842/wst.2016.06.014

R965

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-05-24

修回日期：2016-06-13

＊ 科学技术部“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09103-201-041）：糖脂代谢新药BLP的研究，负责人：邢东明；国家自然科学基金面上项目（81073092）：从G0/G1期启动探讨小檗碱及黄连对缺血再灌损伤神经元保护作用的位点，负责人：杜力军；清华大学室验室开放基金（LF20103581）：神经元细胞周期同步化监测，负责人：杜力军。

＊＊ 通讯作者：邢东明，博士，副研究员，主要研究方向：药理学。