芪叶保肝饮对肝癌细胞增殖和凋亡作用的研究*

牛春红，田新强，朱壮彦

(大同大学，山西大同 037009)

芪叶保肝饮对肝癌细胞增殖和凋亡作用的研究*

牛春红，田新强，朱壮彦

(大同大学，山西大同 037009)

目的:研究芪叶保肝饮(SLPLD)对肝癌细胞增殖和凋亡的作用。方法:研究SLPLD清除DPPH自由基的能力和抗氧化作用;研究不同剂量SLPLD对HepG2细胞增殖与凋亡的作用;建立小鼠肿瘤模型，实验组灌胃SLPLD，至第30天时结束描绘移植瘤生长曲线、称量终末移植瘤质量并计算抑瘤率。结果:SLPLD清除DPPH自由基能力随剂量增加而升高，呈线性相关:R2= 0.9947，IC50=15.74ul;SLPLD对HepG2细胞增殖结果显示细胞数量随SLP着LD剂量增加而减少。流式结果显示随SLPLD使用剂量增加，HepG2细胞凋亡率由9.23%逐渐增加到42.9%;小鼠肿瘤模型第30天时SLPLD实验组肿瘤体积与平均肿瘤重显著小于对照组，肿瘤抑制率为40.3%。结论:SLPLD这一新型中成药具有较强的抗氧化活性，能够抑制HepG2肝癌细胞增长，促进其凋亡。

芪叶保肝饮;HepG2;抗氧化活性;细胞增殖;细胞凋亡

我国每年因肝癌死亡者高达60万人，达全球肝癌患者总数的50%以上，且发病率呈现一定上升势态。当前临床通常采用手术以及放疗和化疗的方式治疗肝癌，对抑制肿瘤细胞的增生起到一定的效果，但往往伴随较大的毒副作用。近年来，中医药治疗肝癌逐步得到认可，中药可以提高机体的抗氧化作用，诱导肿瘤细胞的凋亡，达到防癌治癌的目的［1］。同时中药性质比较温和，对患者身体的损伤较小，具有较强的临床应用和推广价值。

芪叶保肝饮(SLPLD)为治疗肝癌的中成药，主要成分来源于正北芪(恒山黄芪)、松叶、橘叶、竹叶、枸杞和芦根等中药，其中黄芪是生产SLPLD的主要原料。黄芪、枸杞补中益气，具有增强免疫系统功能、保肝、抗肿瘤、清除自由基和抗衰老等作用［2-4］。有研究表明，竹叶黄酮是一种极具开发潜力的天然抗氧化剂［5］。本文通过研究 SLPLD对HepG2肝癌细胞凋亡的作用，初步研究其对小鼠肿瘤生长的影响，为SLPLD抗肿瘤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

BALB/C雄性裸鼠50只，体质量20 g～26 g，购于中科院北京实验动物中心(许可证编号SCXK京2011-0004)，在山西医科大学动物实验中心清洁喂养。

1.2 材料及试剂

SLPLD为中成药，成分包括正北芪(恒山黄芪)、松叶、橘叶、竹叶、枸杞和芦根。人肝癌细胞株HepG2(本实验室保存)，二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)(美国Sigma公司，批号 S43654-098)，Cell Proliferation Reagent WST-1试剂盒、nuclear/cytosolfractionation kit、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光液(美国pierce公司)。

1.3 SLPLD清除DPPH自由基的作用

用PBS将SLPLD稀释成不同浓度，分别取15 μL原液稀释2倍、4倍样品和60 μL 17 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)以及150 μL 1 mmol/L DPPH溶液混合，避光反应30 min。同时用水溶性维生素 E (Trolox)作为阳性对照［3］，乙醇溶液作为颜色空白对照，PBS作为空白对照。均取波长520 nm下的反应液吸光值，最后按下述公式计算:自由基清除率=［OD520(空白对照)－(OD520(样品)－OD520 (颜色对照)/OD520(空白对照)］×100%。得到样品的自由基清除率，在相同DPPH自由基清除率下的样品浓度对应 Trolox浓度，为此浓度样品的Trolox当量浓度。

通过回归分析得出多糖浓度与清除率之间的回归方程，根据方程计算出其IC50(清除率为50%时的浓度)，每组实验重复3次。

1.4 SLPLD对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

1.4.1 HepG2细胞培养 人肝癌细胞株HepG2(本实验室保存)细胞复苏后，于12%胎牛血清的DMEM培养基中培养，含1%的青链霉素(100 IU/ml青霉素和100 ng/ml链霉素)以及2 mM的谷氨酸，于37℃、5%CO2条件下培养。换液周期为1～2 d，3～4 d传代1次。

1.4.2 SLPLD对HepG2细胞增殖的影响 用Cell Proliferation Reagent WST-1(Roche，USA)试剂盒检测HepG2细胞在SLPLD作用下的活力和增殖情况。在96孔板中加入2×104个/孔HepG2细胞，37℃、5%CO2条件下培养12 h后，分别加入5 μL、10 μL、15 μL和20 μL SLPLD处理细胞，对照组分别加入与之相同剂量的PBS(空白对照)和板蓝根溶液(板蓝根注射液，山西太原药业有限公司，阴性对照)孵育18 h。弃上清培养基，PBS洗涤3次，加入20 μL WST-1试剂和180 μL培养基孵育1 h，分别读取各组在450 nm处的吸光值。

1.4.3 流式细胞仪检测SLPLD对HepG2细胞凋亡的作用 ①在6孔板中，每孔加入2×105个/孔HepG2细胞，37℃、5%CO2条件下培养12 h，0 μL、25 μL、50 μL、75 μL、100 μL SLPLD处理16 h，胰酶消化，含12%胎牛血清的培养基终止反应，1000 rpm、8 min离心收集细胞。PBS洗涤3次，1000 rpm、8 min离心收集细胞;②加入500 ul的Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5 ul Armexin VAPC溶液混匀，室温避光反应15 min;③加入5 ul 7-AAD染液混匀，室温避光反应15 min;④1 h内用流式细胞仪检测，激发波长Ex=633 nm，最大发射波长Em=660 nm，Annexin V-APC的红色荧光使用FL4通道检测，激发波长Ex=546 nm，发射波长Em =647 nm，7-AAD红色荧光使用FL3通道检测。Em =647 nm，7-AAD红色荧光使用FL3通道检测。

1.5 SLPLD对小鼠肿瘤生长的影响

1.5.1 小鼠肿瘤模型的建立 取对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化后重悬于PBS中，调整细胞浓度至6.0×106个/ml。每只裸鼠背部皮下注射细胞悬液200 μL，所有实验小鼠均在恒温(25± 1)℃、恒湿(50%±10%)、无特定病原体(SPF)条件下的层流架中饲养，自由饮食。移植肿瘤细胞10 d左右，挑选背部移植的肿瘤大小生长至100 mm3～200 mm3的小鼠20只用于试验。

1.5.2 实验分组 将实验小鼠按随机数字表法分为实验组和对照组2组各10只，实验组灌胃SLPLD 200 μL/只，每天早晚各1次，对照组灌胃同等剂量的生理盐水。

1.5.3 SLPLD对小鼠肿瘤的影响 从首次给药开始，用游标卡尺每天测量记录各组肿瘤体积，用游标卡尺测量肿瘤结节的长度和宽度(精确到0.002 cm)，按公式V=ab2/2计算肿瘤的体积［6］，至第30天时结束实验。在第30天时麻醉并处死裸鼠，手术剥离切除肿瘤组织称重，并用如下公式计算抑瘤率［7］:肿瘤抑制率(%)=［1－(实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)］×100%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLPLD的抗氧化作用

表1显示，SLPLD清除DPPH自由基的能力随剂量增加而升高且呈线性相关。它们之间的线性回归方程为:y=0.029x+0.0434，R2=0.9947，IC50 =15.74 ul。随着自由基清除率的增加，相对Trolox的当量浓度也随之增大。

表1 SLPLD对DPPH自由基的清除作用(±s)

表1 SLPLD对DPPH自由基的清除作用(±s)

SLPLD剂量(μL) 清除率(%) Trolox当量浓度(μg/ml) 3.75 12.3±1.9 24.7± 1.6 7.50 28.2±3.1 41.3± 1.7 15．00 49.9±7.5 75.7± 9.2 30．00 90.3±8.7 180.6±16.8

2.2 SLPLD对HepG2细胞增殖及凋亡影响

2.2.1 SLPLD对HepG2细胞的增殖作用 图1显示，不同剂量板蓝根和PBS处理下的HepG2细胞数量比较差异无统计学意义，SLPLD实验组细胞数量随着剂量增加而减少。15 ul和20 ul的SLPLD实验组HepG2细胞数量显著少于板蓝根组和PBS组(P＜0.05)。

2.2.2 流式细胞仪检测SLPLD对HepG2细胞凋亡的作用 图2显示，X轴表示APC染色荧光，Y轴表示7-AAD染色荧光;A区表示坏死细胞，表现为APC-/7一AAD+;B区表示晚期凋亡细胞，表现为ApC+/7-AAD+;C区表示正常细胞，表现为APC一/7～AAD-;D区表示早期凋亡细胞，表现为APC+/7-AAD-。随着SLPLD剂量的增加，晚期凋亡细胞比例逐渐增加，由9.23%增加到42.9%。

2.3 SLPLD对小鼠肿瘤生长的作用

图1 SLPLD对HepG2细胞增殖的作用

图3、4显示，SLPLD实验组与对照组随着时间增加，肿瘤体积均逐渐增大。第30天时，SLPLD实验组肿瘤体积(7.52±3.63)mm3显著小于对照组(11.07±4.12)mm3(P＜0.05)。称量对照组平均肿瘤质量为(4.57±0.82)g，SLPLD实验组平均肿瘤质量为(2.73±0.82)g，实验组质量小于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，肿瘤抑制率为40.3%。

3 讨论

早在上世纪80年代，人们就发现自由基与癌症的发生密切相关。自由基通过作用于 DNA导致机体遗传物质发生改变，引起蛋白质结构、功能变化，肽键断裂、非正常聚合以及脂质过氧化等，最终可能导致肿瘤的发生［8］。研究发现，采用抗氧化剂干预、阻断自由基的形成，可以预防肿瘤发生［9-10］。本研究显示，SLPLD具有较强的清除自由基的能力。

图2 流式细胞仪检测SLPLD对HepG2细胞凋亡的作用

图3 SLPLD对小鼠肿瘤生长的作用

图4 SLPLD对小鼠肿瘤生长作用变化曲线

宋岩［11］等研究表明，黄芪可显著抑制HepG2细胞增殖，细胞凋亡率随黄芪浓度增加而逐渐升高，存在剂量依赖性。耿国军［12］等研究黄芪对肺腺癌细胞生长的影响，表明不同浓度的黄芪处理后细胞生长受到明显抑制，细胞生长抑制率随黄芪的浓度增加而增长。本研究结果表明，SLPLD能抑制HepG2细胞的增殖。流式细胞仪检测结果显示，随着SLPLD的剂量增加，晚期凋亡细胞比例呈逐渐增加趋势，说明SLPLD具有致HepG2细胞凋亡的作用。

谷俊朝［13］等通过研究黄芪多糖对TA2小鼠乳腺癌MA-891移植瘤生长发现，服用黄芪多糖的小鼠瘤质量有所减轻，具有一定的抑瘤作用。刘成军［14］等研究黄芪注射液对人鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤的抑制作用，结果显示黄芪注射液高、中剂量组移植瘤体积明显低于对照组，瘤质量明显低于对照组，抑瘤率分别为39.90%、30.77%。任美萍［15］等研究表明，黄芪多糖在50、100 mg/kg时，对H22的抑瘤率分别为32.84%、45.09%，对S180的抑瘤率分别为36.55%、50.35%。本研究通过在小鼠皮下注射HepG2细胞建立相应的肿瘤模型，给裸鼠灌胃适量的SLPLD治疗并观察肿瘤生长变化情况，通过测量肿瘤体积以及质量评估SLPLD的治疗效果，结果表明SLPLD对肿瘤的生长有一定的抑制作用。

综上所述，SLPLD这一新型中成药具有较强的抗氧化活性，能够抑制HepG2肝癌的生长，促进肝癌细胞凋亡，并对抑制肿瘤的生长有一定作用，值得临床推广应用。

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Study of Qiye Baogan Decoction on Proliferation and Apoptosis of Hepatocellular Carcinoma Cells

NIU Chun-hong，TIAN Xin-qiang，ZHU Zhuang-yan△
(Datong University，Datong，Shanxi 037009，China)

Objective:To study the role of Qi Ye Bao Gan Yin(SLPLD)in liver cancer cell proliferation and apoptosis．Method:Study the SLPLD’s ability of DPPH scavenging and its antioxidant effect．Research the Effect of different doses SLPLD on appreciation of HepG2 cells．Established the tumor model in mice．The experimental group was given SLPLD．Experiment were ended at the 30thday．Depict the tumor growth curve，weighing the terminal tumor mass，and inhibition rate was calculated．Result:DPPH scavenging ability positively correlated with the dose of SLPLD，and showed．linear correlation R2=0.9947，IC50=15.74ul．SLPLD’s effect on HepG2 cell proliferation and apoptosis showed that in SLPLD experimental group，cell number and the doses of SLPLD were negatively correlated．In SLPLD group with SLPLD dose increase，HepG2 cell apoptosis rate increasing from 9.23%to 42.9%gradually．③At the 30th day，SLPLD tumor volume in experimental group was significantly smaller than the control group．Tumor inhibition rate was 40.3%．Conclusion:The new medicine SLPLD shows a strong antioxidant activity，it can inhibit the growth of HepG2 and promote its apoptosis．

SLPLD;HepG2;Antioxidant activity;Cell proliferation;Apoptosis

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0059-03

2015-05-09

山西省科技厅科技攻关项目-糖尿病、呼吸系统、消化系统疾病发病机制、并发症及影响因素的研究-芪叶保肝饮对酒精性肝病的临床应用研究(20130313017-1)

牛春红(1973-)，女，黑龙江齐齐哈尔人，副教授，医学硕士，从事肝病的临床与研究。