气阴两虚证易诱发心血管事件的实验研究*

庄先飞，柴程芝，寇俊萍，余伯阳

(江苏省中药评价与转化重点实验室，南京 211198)

气阴两虚证易诱发心血管事件的实验研究*

庄先飞，柴程芝，寇俊萍，余伯阳△

(江苏省中药评价与转化重点实验室，南京 211198)

目的:通过实验研究证实气阴两虚证人群更易发生心血管事件，为临床气阴两虚证的合理干预提供参考依据。方法: ICR小鼠按随机数字表法分为空白对照组、异丙肾上腺素组、慢性间歇性缺氧组及慢性间歇性缺氧复合异丙肾上腺素组，测定各组小鼠心电图、超声心动图、血清CK-MB、hs-CRP含量，观察小鼠心脏组织病理变化。结果:与空白对照组比较，各模型组小鼠均出现心脏形态或功能异常，表现为心肌缺血、心肌耗氧量增加、心肌细胞空泡化和心肌酶升高，其中复合模型组损伤最为严重，与异丙肾上腺素组比较差异有统计学意义。结论:模拟气阴两虚证的慢性间歇性缺氧小鼠在给予异丙肾上腺素后，其心肌形态及功能损伤较单纯给予异丙肾上腺素小鼠更为严重，提示气阴两虚证人群在心肌耗氧量增加时有可能更易发生心血管事件，为临床气阴两虚证的合理有效干预提供了实验依据。

气阴两虚证;慢性间歇性缺氧;心肌缺血;心血管事件

急性心肌缺血诱发的心绞痛、心肌梗死等心血管疾病是危害人类健康的重大疾病，其致残率、致死率高，严重影响患者的生活质量，并造成沉重的社会负担［1］。随着人类疾病谱的演变，医疗模式已由单纯的疾病治疗转变为预防、保健、治疗、康复相结合的模式，疾病的早期预防越来越引起医药工作者的重视。文献及临床流行病学研究均显示，气阴两虚证是临床常见证型［2］860，常见于冠心病［3］、慢性心力衰竭［4］、急性心肌梗死［5］等心血管疾病，提示气阴两虚证患者可能存在心脏形态与功能的异常变化，在心肌耗氧量突然增加的情况下，更易诱发心绞痛、心肌梗死等心血管事件，但目前尚缺乏临床流行病学研究的相关报道。

本研究在课题组前期研究的基础上，采用能够模拟气阴两虚证临床特征的慢性间歇性缺氧(CIH)动物模型为实验平台［6-7］，考察慢性间歇性缺氧小鼠在急性心肌耗氧量增加时心脏形态与功能的变化，试图从实验研究角度评价气阴两虚证人群对心脏病事件的易感性，为临床气阴两虚证的合理有效干预提供参考。

1 材料

1.1 试剂

CK-MB ELISA试剂盒、hs-CRP ELISA试剂盒均由南京市建成生物工程研究所提供;盐酸异丙肾上腺素注射液，上海禾丰制药有限公司(国药准字H31021344，批号130701);氯化钠注射液，国药准字H37022336(批号1307171334)。

1.2 动物

雄性ICR小鼠，体质量(22±2)g，由扬州大学比较医学动物中心提供(动物合格证号SCXK(苏) 2012-0004)。

1.3 仪器

XF-YC06型低压氧仓全自动控制仪(简称低压氧仪，南京新飞分析仪器制造有限公司);Vevo2100型超声心动仪(简称超声仪，加拿大Visual Sonics公司);BL-420S生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);DFC450C型显微镜(德国莱卡公司)。

2 方法

2.1 造模方法

32只雄性ICR小鼠按随机数字表法分为空白对照组(Control)、异丙肾上腺素组(ISO)、慢性间歇性缺氧组(CIH)及慢性间歇性缺氧复合异丙肾上腺素组(CIH+ISO)，每组各8只饲养于同一笼内。Control组及ISO组小鼠自由进食、饮水，CIH组及CIH+ISO组小鼠自由饮水，每晚9点开始持续禁食12 h，次日9点前放入氧分压为7%～8% 的低压氧仪中持续缺氧20 min，每天1次，连续14 d。ISO组及CIH+ISO组小鼠在第15天尾静脉注射盐酸异丙肾上腺素注射液(ISO)0.1 ml/10 g(相当于异丙肾上腺素5 mg/kg)，其余组小鼠尾静脉注射等量的氯化钠注射液。

2.2 观测指标

2.2.1 心电图测定 小鼠缺氧第15天腹腔注射4%水合氯醛0.1 ml/10 g麻醉，采用BL-420S生物机能实验系统心电模式，描记尾静脉注射ISO前后的小鼠心电图，观察小鼠T波抬高情况。

2.2.2 超声检测 小鼠第15天麻醉后，于尾静脉注射0.5 h后，采用超声心动仪检测左心室射血分数(EF)和缩短分数(FS)。

2.2.3 血清中CK-MB、hs-CRP含量测定 小鼠尾静脉注射ISO后2 h眼底静脉丛取血，4℃沉降30 min后3500 r/min离心15 min，取上清分装置于－70℃待测。采用酶联免疫试剂盒测定CK-MB、hs-CRP的含量。

2.2.4 病理组织检测 将小鼠离体心脏浸泡于福尔马林溶液中24 h用石蜡包埋后切片，采用HE染色处理后于光镜下观察心脏的病理变化。

2.2.5 统计学方法 采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，以均数±标准差(±s)表示，各组采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 心电图测定

图1显示，与空白组比较，ISO及CIH+ISO组小鼠心电图均表现为T波抬高，提示有心肌缺血表现。

图1 不同模型组小鼠心电图T波变化

3.2 超声检测

图2、3显示，与空白组比较，ISO及CIH+ISO组小鼠心脏的EF和FS显著升高(P＜0.01)，且与ISO组小鼠心脏的EF和FS比较，CIH+ISO组升高更显著(P＜0.01)，提示复合模型小鼠心肌耗氧量较单纯异丙肾上腺素组显著升高。

图2 不同模型组小鼠超声心动检测图

图3 不同模型组小鼠左心室射血分数EF(A)、缩短分数FS(B)统计柱状图

3.3 血清中CK-MB、hs-CRP含量测定

图4显示，与空白组比较，各模型组小鼠心脏组织中CK-MB和hs-CRP含量明显升高(P＜0.01)，提示各模型组小鼠心脏都存在不同程度的损伤; CIH+ISO组小鼠心脏的CK-MB和hs-CRP含量升高最明显，与ISO组比较差异有统计学意义，提示复合模型的心肌损伤更严重。

图4 不同模型组小鼠血清CK-MB(A)、hs-CRP(B)含量

3.4 病理组织检测

图5显示，空白组小鼠心肌细胞光镜下胞浆红染、横纹清晰、核居中，心肌间质无炎细胞浸润，无结缔组织增生。与空白组比较，各模型组心肌细胞均出现轻微或轻度空泡变性，其中复合模型组损伤最严重。

图5 不同模型组小鼠心脏病理切片图(A)及病理损伤评分(B)

4 讨论

课题组在前期研究中已采用益气养阴的代表方生脉散干预，通过“以方测证”的方法初步确证慢性间歇性缺氧小鼠模型的气阴两虚证候属性［7］。本研究则进一步比较了慢性间歇性缺氧小鼠与慢性间歇性缺氧复合异丙肾上腺素造模小鼠心肌形态及功能的变化，验证模拟气阴两虚证的慢性间歇性缺氧小鼠在急性心肌耗氧量增加的情况下心脏损伤加重的可能性。

心电图及超声心动图是临床考察心脏功能与形态的常用检测方法，小鼠心电图T波抬高提示有心肌缺血改变［8］。超声心动图结果也显示，ISO作为β受体激动剂，可以明显升高左心室射血分数及缩短分数，增加心肌耗氧量，加重心肌缺血损伤。本研究结果显示，CIH+ISO组小鼠心肌耗氧量较单纯ISO组明显增加，心肌缺血程度更严重。

CK-MB是临床用于诊断心肌梗死的常用血清学指标，曾被誉为诊断急性心肌梗死(AMI)的金标准［9］。C反应蛋白(CRP)是肝脏合成的急性期反应蛋白，是炎症、感染及组织损伤的非特异性产物，也是急慢性炎症反应的敏感标志物。超敏CRP(hs-CRP)因其较高的检测精度，目前常用来预测冠心病事件的发生［10］。本研究考察了不同模型组小鼠血清CK-MB和hs-CRP的含量，结果提示CIH+ISO组小鼠较单纯ISO组小鼠的心肌损伤程度更严重，发生冠心病、心肌梗死的风险更高。组织病理切片是评价动物器官损伤程度的“金指标”，本研究考察了不同模型组小鼠心脏组织病理切片的变化，结果与血清学指标的检测结论相一致。

综上所述，本研究采用临床常用的检测指标结合经典的实验室检测指标，考察了模拟气阴两虚证的CIH小鼠在急性心肌耗氧量增加时心电图T波、左心室射血分数(EF)及缩短分数(FS)的变化，血清CK-MB、hs-CRP的含量以及心肌细胞的病理变化特点，发现CIH小鼠给予ISO后心脏形态与功能的损伤较ISO组更为严重。提示气阴两虚患者在突遇急性心肌耗氧量增加事件时，心肌损伤将较正常人群更严重。本研究为气阴两虚证患者的预防与保健以及气阴两虚证适时干预以减少心脏不良事件的发生提供了参考依据，该结论还有待于临床流行病学研究的进一步验证。

［1］苏定冯，陈丰原．心血管药理学［M］．北京:人民卫生出版社，2011:621．

［2］赵琼，严石林，陈为，等．论气阴两虚证发展源流［J］．中国中医基础医学杂志，2010，10:853-854．

［3］石刚，刘婷，程丑夫．冠心病常见证候临床流行病学调查［J］．中华中医药学刊，2007，25(8):1675-1676．

［4］邹旭，潘光明，盛小刚，等．慢性心力衰竭中医证候规律的临床流行病学调查研究［J］．中国中西医结合杂志，2011，31 (7):903-908．

［5］王玲，邹志东，刘红旭．急性心肌梗死中医证候规律研究［J］．中国中医急症，2007，16(3):302-305，310．

［6］Chai CZ，Kou JP，Zhu DN，et al．Mice Exposed to Chronic Intermittent Hypoxia Simulate Clinical Features of Deficiency of both Qi and Yin Syndrome in Traditional Chinese Medicine［J］．eCAM，2011，doi:10.1093/ecam/nep226．

［7］王文萍，柴程芝，寇俊萍，等．基于“方证相应”理论验证慢性间歇性缺氧模型气阴两虚证候属性的初步研究［J］．中国中医基础医学杂志，2012，18(1):50-52，．

［8］Zhangyu Yao，Shubo Gong，Teng Guan，et al．Synthesis of ranolazine metabolites and their anti-myocardial ischemia activities［J］．Chem Pharm Bull，2009，57(11):1218-1222．

［9］崔杰峰，潘柏申．急性心肌梗死血清标志物沿革［J］．上海医学检验杂志，2000，15(1):13-14．

［10］Kinjo K，Sato H，Ohnishi Y，et al．Impact of high-sensitivity C-reactive protein on predicting long-term mortalityofacute myocardial infarction［J］．Am J Cardiol，2003，91:931-935．

Experimental study on cardiovascular events can be easily induced by the Qi-yin deficiency syndrome

ZHUANG Xian-fei，CHAI Cheng-zhi，KOU Jun-ping，YU Bo-yang△
(Jiangsu Provincial Key Laboratory for TCM Evaluation and Translational Research，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China)

Objective:To confirm the tendency of those people with Deficiency of both qi and yin syndrome(DQYS) suffering from cardiovascular events by experimental research，and to provide a reference for rational management with DQYS people．Methods:Male ICR mice were randomly divided into the control group，Isoprinosine(ISO)group，chronic intermittent hypoxia(CIH)group，and the group of CIH combined with ISO(CIH+ISO)．Then electrocardiogram and ultrasonic cardiogram were both adopted to examine the alteration of T wave and ejection fraction(EF)．Serum contents of CK-MB and hs-CRP were both determined by ELISA，and the cardiac pathological changes were observed by HE stain．Results Compared with the control group，mice in model group presented abnormal cardiac morphology or function，manifested as myocardial ischemia，increased myocardial oxygen consumption and myocardial cell vacuolization，as well as myocardial enzyme elevation．Among the three model groups，especially the mice in CIH+ISO group showed the most serious injury(P＜0.05，compared with the ISO group)．Conclusion:Mice exposed to CIH condition could simulate the main clinical features of DQYS，and injection of ISO could induce the CIH model mice to present more serious cardiac damage compared with the ISO model mice．The results showed that people with DQYS are inclined to suffer from cardiovascular events，such as angina，myocardial infarction，etc．The present study also provided a rational management proposal for those susceptible people with DQYS．

Deficiency of both qi and yin syndrome;chronic intermittent hypoxia;myocardial ischemia; cardiovascular events

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0047-03

2015-05-12

江苏省科技厅临床医学科技专项(BL2012060);国家自然科学基金青年基金项目(81303076);国家自然科学基金面上项目(81274004)

庄先飞(1990-)，女，山东泰安人，医学博士，从事中药复方作用机制研究。

△通讯作者:余伯阳，教授，博士研究生导师，从事中西医结合药学研究，E-mail:boyangyu59@163．com。