脾虚证糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型的建立及评价*

王宁丁，刘晓秋，伍军军，陈 嘉，周钱粮，陈英杰，张永斌△

(1．广州中医药大学实验动物中心，广州 510405;2．广州中医药大学脾胃研究所，广州 510405; 3．广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405)

脾虚证糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型的建立及评价*

王宁丁1，刘晓秋2，伍军军1，陈 嘉1，周钱粮1，陈英杰3，张永斌1△

(1．广州中医药大学实验动物中心，广州 510405;2．广州中医药大学脾胃研究所，广州 510405; 3．广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405)

目的:建立带有脾虚证的糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型并对其进行评价。方法:采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)结合30%乙醇灌胃的方法建立糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型，通过大鼠宏观表征采集、血糖监测、抓力测定、旷场实验、爪和尾的RGB值等进行脾虚证的诊断及考证。结果:第4～10周模型组大鼠持续消瘦，拉力测定值降低，旷场活动减弱，舌质变淡，爪和尾的r值降低，排便次数增加，粪便变软或便溏，83%的模型动物出现糖尿病疾病特征、气虚证1项和脾的组织定位体征1项以上指征。结论:腹腔注射STZ结合30%乙醇灌胃的方法成功建立糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型，并发现建模后第4～10周可能为糖尿病大鼠脾虚证的时间窗。

糖尿病大鼠;胃黏膜损伤;脾虚证;动物模型

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已经成为继心脑血管疾病和癌症的世界第三重大疾病［1］，糖尿病并发症是决定糖尿病患者预后的最主要因素，已成为世界性难题。DM属于中医消渴病范畴，近现代大量研究表明［2-4］，脾虚乃糖尿病的发病之本，也是糖尿病的中医病机，而DM胃肠病变是其最常见的并发症之一。为规范1型糖尿病胃黏膜损伤模型建立，并对病证结合动物模型进行研究，本实验采用STZ腹腔注射加30%乙醇灌胃的方法，诱发1型糖尿病动物胃黏膜损伤模型，动态观察动物临床症状、血糖、体质量等，并根据中医理论模拟临床望、闻、问、切和辨证方法，对糖尿病大鼠的宏观表征和行为学变化进行评价，确定糖尿病大鼠脾虚证出现的时间窗，为病证结合研究并指导临床用药提供实验性依据。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

雄性SPF级SD大鼠73只，体质量260～280 g，购于广州中医药大学实验动物中心(动物生产许可证号SCXK(粤)2008-0020)。STZ(Sigma公司)、稳毫型血糖试纸(强生上海医疗器材公司)、柠檬酸(广州医药站化学试剂综合公司)、柠檬酸三钠(成都化学试剂厂)。

1.2 分组及造模

SD大鼠造模前测体质量和血糖，经禁食不禁水12 h后按随机数字表法分为正常组(29只)和模型组(44只)。模型组动物腹腔注射1%STZ溶液(用0.1 mol/L，pH4.2的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制成10 g/L的溶液)，剂量5.5 ml/kg，正常组大鼠腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液5.5 ml/kg。注射STZ 72 h后监测随机血糖，连续3次血糖值≥16.8 mmol/L，且有多饮、多尿、多食症状入选糖尿病动物模型。造模同时每周大鼠灌胃30%乙醇1次，剂量10 ml/kg，连续4周。观察16周动态采集糖尿病大鼠的宏观表征，第16周末取胃组织做病理切片，HE染色观察其病理变化。

1.3 体质量、摄食量、饮水量和尿量

每周称量动物体质量，每月2组动物各取6只做代谢笼监测，记录动物24 h饮水量、食料量和尿量。体质量用以判断其阴盛衰度，食量用以判断脾胃、胃气及相关病证，饮水量用以判断寒热、阴阳及相关病证，每2周测量1次，连续16周。

1.4 计算爪、尾RGB值

在相同光照下，相机放大3倍拍摄大鼠左后爪和尾，记录爪、尾详细外观及红色程度，相片用PhotoShop7.0图像软件进行图像处理，选取爪的掌部和尾中部作为RGB色度的定量分析，R代表红色，G代表绿色，B代表蓝色，计算出反映爪和尾红色程度r值，r=R/(R+G+B)，每2周拍摄1次，连续16周。

1.5 抓力测定实验

毛巾放置在平台上并与电子拉力计相连，将大鼠放置毛巾上并向后拉，大鼠前肢由于本能反应会抓住毛巾，前爪松开毛巾时的拉力即大鼠的最大抓力。抓力值用于判断气盛衰度，每2周测量1次，连续16周。

1.6 旷场试验

本实验所用敞箱为立方形，高40 cm，长宽均为50 cm，底面分成面积相等的25块。以大鼠穿越的格子数作为水平活动得分，动物穿越1格为1次，如动物沿线行走每10 cm为1次。以直立次数为垂直活动得分，双前肢离地为1次。每只动物测试1次，每次3 min。敞箱测试中的水平活动得分反映大鼠的活动度，垂直活动得分反映大鼠对周围事物的兴趣高低，每2周测量1次，连续16周。

1.7 脾虚证判定标准

参考1987年卫生部药政局颁布的《中药治疗脾虚证的临床研究指导原则》和汤家铭主编的《医学实验动物学》，从大鼠的表征推断脾虚证证候疾病诊断依据:随机血糖≥16.8 mmol/L;证候诊断依据:气虚证如乏力、疲倦、活动减少、旷场活动减弱和舌胖大边有齿痕等;脾的组织定位体征如乏力、懒动、肌体萎软不用、消瘦、枯槁无泽、食欲不振、大便异常、腹部胀满、肛门污秽等。动物模型具备:疾病诊断依据+气虚证1项+脾的组织定位体征1项以上即可。

1.8 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，均数比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 动物建模情况

表1、2显示，模型组大鼠出现多饮多食多尿且体型消瘦的“三多一少”特征，30%乙醇灌胃4周后，模型动物粪便逐渐变稀、肛周污秽。结合血糖监测结果显示，已建立较稳定的糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型。观察到第4周时，糖尿病模型的成模率为75%，基本与文献报道相近。观察至第16周时，糖尿病胃肠损伤模型的成模率为61.4%。

表1 2组大鼠血糖、体质量、食量、饮水量和尿量比较

表2 SD大鼠成模率与死亡率(只)

2.2 爪和尾的RGB值

表3显示，正常组大鼠舌质淡红，略暗润泽，反映大鼠红色度的r值处于正常范围;模型组大鼠舌质偏淡，舌胖大边有齿痕，爪略显干，尾显苍白，r值从第4周起明显降低，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 抓力测定结果

表3显示，正常组大鼠抓力随日龄增加而有所变化，但变化比较平缓;模型组动物注射STZ后开始消瘦、蜷缩，第4周起抓力明显小于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.4 旷场实验结果

表3显示，正常组大鼠活动正常，模型组动物第4周后在旷场实验箱里缩懒动，对周围事物兴趣度降低，穿格次数与直立次数均少于正常组，第4周、第6周差异有统计学意义(P＜0．05，P＜0.01)。

表3 2组大鼠抓力、爪及尾RGB值和旷场试验结果

2.5 大鼠胃黏膜病理染色结果

图1显示，正常组大鼠胃黏膜上皮细胞连续性好，黏膜层次结构清楚，黏膜肌层和黏膜下层未见毛细血管扩张瘀血。模型组大鼠胃黏膜层上皮细胞黏液变薄、缺失、细胞间隙变大，有轻度的坏死，胞浆有空泡变形成，毛细血管可见有扩张和炎细胞浸润。

图1 2组大鼠胃黏膜病理组织图(HE染色×100)

2.6 初步确定糖尿病大鼠脾虚证时间窗

模型组大鼠腹腔注射STZ 72 h后，随机血糖普遍升高并出现糖尿病疾病特征，第2周起部分模型大鼠开始消瘦，活动减少，体质量下降，毛色枯槁无泽，排便次数增加;第4～10周模型组大鼠持续消瘦，拉力测定值降低，旷场活动减弱，舌质变淡，爪和尾的r值降低，排便次数增加，粪便变软或便溏，83%的模型动物出现糖尿病特征、气虚证1项和脾的组织定位体征1项以上指征，初步辨证为脾虚证，因此腹腔注射STZ后第4～16周应为糖尿病大鼠脾虚证的时间窗。

3 讨论

糖尿病属于中医“消渴”范畴。中医的证是临床生理或病理变化的客观反映，其生理或病理变化是可以通过实验指标来表达的。目前多数病证结合模型的造模及评价方法将证候和疾病人为分开，两套方法、两种标准整合在同一动物上。虽然这种评价方法是现在最常用也是有一定根据和理论支撑的，但这种方法常常是证候指标和病理指标的简单相加，将病证结合模型中证候和疾病的关联性忽视了。寻找中医证候与疾病病理状态关联性大的检测指标，将有利于中医证候的客观化。如冯博等［5］探讨了胰升血糖素样肽-1(GLP-1)与糖尿病脾虚证的关系;龚燕冰等［6］总结了内皮素、脂质、免疫系统、性激素、垂体-肾上腺轴激素、NO、酪氨酸蛋白激酶(Ins-RTPK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞素-6(IL-6)等与糖尿病证候的关系，但中医证候本身的复杂性决定了证候与客观指标之间不可能存在线性关系，该类研究存在一定的局限性。

本研究在“有病便是有证”思想指导下，在未叠加其他证候造模因素条件下，利用STZ诱发雄性SD大鼠脾虚证1型糖尿病模型，并结合30%乙醇灌胃促进糖尿病大鼠胃黏膜损伤的发生，利用现代医学评价方法，计量化中医四诊信息并做统计学处理，筛选出稳定的疾病动物模型，分别进行基本宏观表征、特性宏观表征的动态采集及行为学实验检测;临床症状与动物表征的等效转化并做证候属性识别;微观理化指标病理切片检测、确定了1型糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型脾虚证的时间窗。该项研究体现了中医思想并为糖尿病动物模型和中医证候研究提供了一定的背景资料。

［1］田婷，马向华，沈捷．2型糖尿病动物模型研究概况［J］．医学综述，2011(6):905-908．

［2］潘善余．糖尿病从脾论治探讨［J］．浙江中医杂志，2004，39 (1):6-7．

［3］陈长青，熊曼琪，李赛美．消渴病(糖尿病)的病机研究进展［J］．中国中医基础医学杂志，2002(10):72-74．

［4］贺文广，杨竞，钟丽红．杨竞从脾论治糖尿病的经验［J］．上海中医药杂志，2005，39(3):27-28．

［5］冯博，孙丰雷，徐学敏．浅探胰升血糖素样肽-1水平与糖尿病脾虚证的关系［J］．江苏中医药，2012(11):7-9．

［6］龚燕冰，高思华，倪青．糖尿病中医证候的微观机制探析［J］．中国中医药信息杂志，2007，14(5):94-96．

Establishment and evaluation of gastric mucosal damage model in diabetic rats with spleen deficiency syndrome

WANG Ning-ding1，LIU Xiao-qiu2，WU Jun-jun1，CHEN Jia1，ZHOU Qian-liang1，CHEN Ying-jie3，ZHANG Yong-bin1△
(1．Laboratory Animal Research Center，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2．Pi-Wei Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 3．First Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

Objective:The research aimed to observe and evalute the damage model of gastric mocosa in diabetic rats with spleen deficiency．Method:The damage model of gastric mucosa in diabetic rat produced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)in combination with 30%ethanol．Through macroscopic characterization of acquisition in rats，blood sugar monitoring，holding power measurement，open-field test and the claws and tail of the RGB values to diagnosis and evaluate spleen-deficiency syndrome．Result:Observed 4thto 10thweeks，the study found that rats in model group continuous thin，tension values were lower，open-field activities were weaken，tongue nature turn light，the RGB values of claws and tail were lower，increase of the times．of stool and change to soft or loose，and 83%of the animal model appeared diabetes disease characteristics，one deficiency syndrome，and the organization of the spleen positioning signs 1 or more indications．Conclusion:The damage model of diabetic rat gastric mucosa could be successfully induced by intraperitoneal injection method of STZ in combination with ethanol，and the time window for the appearance of spleen deficiency was 4-10 weeks．

diabetic rat gastric mucosal injury;Spleen deficiency syndrome; Animal model

R-587．1

A

1006-3250(2016)01-0038-03

2015-02-20

广东省科技计划资助项目(2010B060500013，2011B060300007);国家级大学生创新创业训练计划项目(201310572021)

王宁丁(1990-)，女，医学硕士，从事人类疾病模型建立及药效的临床与研究。

△通讯作者:张永斌，男，副研究员，医学博士，E-mail:zyb-73 @163．com。