M2和M3型胆碱能受体在脾气虚大鼠小肠运动中的作用*

赵 璠，刘旭东，刘文俊，柴纪严，于化新，王凌志，王 路，王德山，单德红

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

M2和M3型胆碱能受体在脾气虚大鼠小肠运动中的作用*

赵 璠，刘旭东，刘文俊，柴纪严，于化新，王凌志，王 路，王德山，单德红△

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

目的:研究M2、M3型胆碱能受体表达与脾气虚小肠运动的关系。方法:20只SD大鼠按随机数字表法分为对照组和脾气虚模型组(模型组)各10只，模型组大鼠复制饮食不节加劳疲型脾气虚模型;小肠运动采用小肠推进率评价;ELISA法检测小肠组织Ach和cAMP含量，免疫组化法观察M2、M3型受体表达。结果:与对照组比较，模型组大鼠的小肠推进率显著下降，Ach含量无变化，M2受体表达明显上升，M3受体表达和cAMP水平显著下降。结论:脾气虚小肠运动减弱与M2、M3型受体表达异常有关。

脾气虚;小肠运动;M型胆碱能受体;Ach;cAMP

小肠运动异常是脾气虚的常见症状，其现代医学机制至今未明。小肠平滑肌受迷走神经和肠内神经支配，其末梢均可大量释放乙酰胆碱(Ach)，再通过M2、M3型胆碱能受体共同调控小肠运动。研究发现，Ach结合M3受体可通过多条途径提高胞内Ca2+浓度，在平滑肌收缩中起主要作用，而M2受体激活则能抑制腺苷酸环化酶活性，降低cAMP水平，间接控制平滑肌收缩［1-2］。胆碱能系统是调控胃肠功能最经典的系统，但其与脾气虚的关系至今尚不清楚。因此，本研究以饮食失节加劳倦型脾气虚大鼠为载体，通过检测小肠推进率、小肠组织Ach水平、M2和M3受体表达及cAMP含量等，探讨脾气虚状态下小肠运动与M2、M3受体的关系。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

20只SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±10)g，购于辽宁省本溪巿实验动物中心(许可证号SCXK (辽)-2010-0001)，按随机数字表法分为对照组和脾气虚组(模型组)各10只。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心(许可证号SYXK(辽)-2013-000-9)，室温18℃～23℃，相对湿度45%～55%，自由饮水进食，适应性饲养1周后开始实验。

1.2 模型复制方法及评价标准

复制饮食失节加劳倦型脾气虚模型，即14 d内单日饱食，双日喂饲甘蓝，每日水温35℃～37℃游泳至力竭。评价标准:大鼠出现体质量下降、食少、神疲乏力、毛色枯槁无光泽等。

1.3 大鼠代谢水平检测

造模结束后，先测量2组大鼠体质量再放入代谢笼，观察24 h进食量、饮水量、尿量、大便含水率［(大便湿重－大便干重)÷大便湿重×100%］。

1.4 大鼠神疲乏力评价

采用旷场实验评价其中枢性疲劳，即神疲;前肢抓力评价躯体疲劳，即乏力。旷场实验采用TMVision行为学实验系统，将大鼠放入箱体中心，观察5 min内大鼠的静止时间、运动时间、运动距离和垂直活动次数等，彻底清洁箱体后检测下一只。大鼠前肢抓力采用YLS-13A大小鼠抓力测定仪检测，连续测量3次取平均值。

1.5 小肠推进率测定

大鼠禁食不禁水24 h后，给予10%炭粉混悬液(5%活性炭和10%阿拉伯胶)灌胃(1 ml/100 g)，30 min后麻醉大鼠(10%水合氯醛，0.35 ml/100 g)，打开腹腔提取幽门至回盲部的肠管，用直尺测量炭末推进距离。按公式计算:小肠推进率=炭粉前端至幽门括约肌距离(cm)/幽门括约肌至小肠末端距离(cm)×100%。

1.6 小肠组织Ach、cAMP水平检测

麻醉大鼠后取幽门下1 cm～2 cm小肠，4℃盐水洗去内容物冻存。采用ELISA方法，Ach试剂盒购于沈阳鼎国生物技术有限公司，cAMP试剂盒购于北京冬歌博业生物技术有限公司，应用Bio-Rad美国伯乐iMark酶标仪按说明书操作。

1.7 M2和M3受体表达

采用免疫组化方法。取4%多聚甲醛固定后小肠，放入PBS液漂洗，PBS冲洗3次×5 min;滴加正常山羊血清，室温20 min;滴加兔抗大鼠M2或M3抗体(购于沈阳鼎国生物技术有限公司)，4℃过夜，PBS冲洗3次×5 min;滴加生物素标记羊抗兔IgM抗体，室温30 min，PBS冲洗 3次 ×5 min;加入SABC试剂，室温30 min，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照采用抗体稀释液代替一抗，步骤同上。利用BI-2000系统，在光镜下(10×40倍)选取相同部位相同视野照相分析，计算每个视野阳性染色的平均光密度(MOD)。

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据均以均数±标准差(±s)表示，主要采用ANOVA进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型评价结果

表1、2图1显示，与对照组比较，模型组大鼠的体质量、进食量及饮水量均显著下降(P＜0.05，P＜0.01)，表明大鼠出现消瘦、食少;静止时间显著延长(P＜0.01)，运动时间、运动距离、垂直活动次数均显著减少(P＜0.05，P＜0.01)，提示大鼠对新鲜环境刺激减弱，反应较差，表明其中枢神经系统的兴奋性下降，出现“神疲”;大鼠前肢抓力均显著下降(P＜0.05)，提示其肌力不足，处于“乏力”状态;肉眼可见大鼠被毛蓬起无光泽。以上结果表明，饮食失节加劳倦型脾气虚模型复制成功。

表1 大鼠一般生物指征(±s)

表1 大鼠一般生物指征(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 鼠数 体质量(g) 进食量(g) 饮水量(ml) 尿量(ml) 粪便含水率(%)对照组 10 362.58±24.81 33.03±10.90 86.3±21.6 9.6±3.8 24.21±5.94模型组 10 244.28±15.13＊＊ 24.52± 6.50* 55.2±13.7＊＊11.2±1.5 21.45±8.21

表2 大鼠神疲乏力情况(±s)

表2 大鼠神疲乏力情况(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 鼠数 静止时间(s) 运动时间(s) 运动距离(cm) 垂直活动次数(次/5 min) 前肢抓力(g)对照组 10 243.27±10.34 56.74±10.34 9512.90±1881.5920.6±5.9 1363.54±105.83模型组 10 267.85± 7.82＊＊ 32.18± 7.83＊＊ 4930.35±1253.18＊＊ 15.3±3.6* 1215.54±127.72*

表3 小肠推进率及胆碱能系统相关指标变化(±s)

表3 小肠推进率及胆碱能系统相关指标变化(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 鼠数 小肠推进率 Ach(μmol/L) M2受体表达 M3受体表达 cAMP(μmol/L)对照组 10 60.1±13.1 3.42±0.40 0.119±0.011 0.179±0.011 13.52±1.59模型组 10 46.4± 3.7* 3.37±0.51 0.214±0.010＊＊ 0.131±0.006＊＊ 10.63±2.11*

图1 大鼠典型运动轨迹(0→MAX表示停留时间增加)

2.2 小肠推进率及胆碱能系统相关指标变化

表3显示，与对照组比较，模型组大鼠的小肠推进率、M3受体表达和cAMP水平均明显下降(P＜0.05，P＜0.01)，而 M2受体表达显著上升(P＜0.01)，但Ach含量无变化(P＞0.05)。

3 讨论

小肠推进率是评价脾气虚小肠动力的常用指标，但实验结果不尽相同，这可能与模型的复制方法不同有关［3-5］。本实验采用模型复制方法为复合因素法，但由于脾气虚的病因较多，如饮食不节、劳倦过度、忧思日久、素体虚弱、年老体衰、大病初愈等，难以全面模拟，因此只模拟前二者，即将饥饱失常和力竭游泳作为干预因素，这符合“饮食自倍，肠胃乃伤”、“谷不入，半日则气虚，一日则气少”、“劳则气耗”等中医理论，从而在入口处使模型复制具有一定的脾气虚趋向性。而在模型复制的出口处，通过对相关症状进行客观性评价，确保模型复制成功。需要提出的是，该模型并不具备脾气虚的全部内涵，可能更适用于消化吸收方面的研究。

以此模型为载体，本实验观察到大鼠的小肠推进率下降，表明此种脾气虚模型大鼠的小肠动力不足。作为调控胃肠功能的最经典神经系统之一，胆碱能系统在脾气虚中的作用虽早有研究，但随着现代医学的不断发展，其与脾气虚的关系也应有新的进展。胃肠道主要分布2种胆碱能受体M2和M3，二者共同调控胃肠平滑肌运动，但作用不同。M2受体起条件作用，能够抑制腺苷酸环化酶，降低cAMP水平，限制平滑肌舒张，还能激活非选择性阳离子通道，如促进Na+内流，使平滑肌细胞去极化，提高其兴奋性［6-7］;M3受体起主导作用，主要通过磷酯酶Cβ促进三磷酸肌醇、二酰甘油等合成，提高胞内Ca2+浓度，引起平滑肌收缩，还可以对M2受体介导的阳离子流起允许作用［8］。脾气虚状态下，小肠平滑肌M2和M3受体的作用目前还未见报道。

本实验观察到，模型组大鼠小肠组织中Ach的含量无显著变化，但M2受体表达增多、M3受体表达减少，同时伴有cAMP含量下降，这表明脾气虚状态下，胆碱能神经节后纤维释放Ach的能力虽无明显变化，但效应器应答却发生了变化。M3受体表达减少，会降低胞内Ca2+水平，导致平滑肌收缩力明显下降，而M2受体表达增加虽会在一定程度上增强平滑肌的收缩功能，但其作用有限，难以弥补由M3受体表达下降所造成的肌力损失，特别是M3受体表达下降还会削弱M2受体所介导的内向阳离子流，导致平滑肌去极化程度下降，进而降低其兴奋性，使小肠平滑肌对肠道内容物的刺激不敏感。因此，M3受体表达减少和M2受体表达增多，可能就是脾气虚小肠运动变弱的主要原因。不过需要指出的是，小肠平滑肌有纵行肌和环形肌2种，收缩方式不同，而本实验并没有加以区分，这将在以后实验中进行深入探讨，进一步揭示脾气虚状态下小肠的不同运动形式与胆碱能受体的关系。

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Role of M2and M3Type Cholinergic Receptors in the Small Intestine of Rats with Spleen Qi Deficiency

ZHAO Fan，LIU Xu-dong，LIU Wen-jun，CAI Ji-yan，YU Hua-xin，WANG Ling-zhi，WANG Lu，WANG De-shan，SHAN De-hong△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China)

Objective:To study the roles of M2and M3receptors in the small intestine(SI)movement of Spleen-Qi deficiency rats．Methods:20 male SD rats were randomly divided in the control and Spleen-Qi deficiency(model group) groups，10 rats in each group;Spleen-Qi deficiency model of improper diet and over-fatigue type was established;The SI propelling rate was used to valuate the SI motion;ELISA was used to measure the Ach and cAMP concentrations in SI tissue;Immohistochemistry was employed to test expressions of M2and M3receptors．Results:compared with those in control，the SI propelling rate was significantly reduced，Ach concentration was not changed，M2receptor expression was markedly increased．Both M3receptor expression and cAMP concentration were significantly decreased in the model group．Conclusion:the reduction of the SI motion in Spleen-deficiency model rats was contributed to the abnormal expressions of M2and M3receptor．

Spleen-Qi deficiency;small intestine motion;M cholinergic receptor;Ach;cAMP

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0041-03

2015-02-12

国家重点基础研究发展计划(973计划) (2013CB531702)

赵 璠(1977-)，女，主治医师，医学学士，从事中医药防治消化疾病的基础与临床研究。

△通讯作者:单德红，男，教授，医学博士，Tel:024-31207089，E-mail:dehongshan@lnutcm．edu．cn。