低氧预处理骨髓间充质干细胞减轻脊髓缺血再灌注损伤的作用机制

孙鑫 沈康平金文杰 刘兴振 陶海荣

低氧预处理骨髓间充质干细胞减轻脊髓缺血再灌注损伤的作用机制

孙鑫 沈康平*金文杰 刘兴振 陶海荣

脊髓缺血再灌注损伤是脊柱减压手术后常见的并发症，骨髓间充质干细胞椎管鞘内移植为治疗此损伤的有效方法之一。目前许多研究表明低氧预处理可促进骨髓间充质干细胞功能并减轻脊髓缺血再灌注损伤，因此本文拟就此作用的相关机制进行综述。

脊髓；缺血再灌注损伤；BMSCs；低氧；预处理

脊髓缺血再灌注损伤（Spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCII）常发生于脊髓慢性受压患者的减压术后早期，其发生率通常在3.5%～14.5%之间[1]，其临床症状较重，可出现原受压平面以下全部或部分脊髓损伤症状[2,3]。近年来随着人们对脊髓损伤后病理生理机制的认识不断加深，对于SCII的治疗方法经历了许多改变。目前该方面的研究热点主要集中在将骨髓间充质干细胞（Bone marrow stem cells, BMSCs）进行低氧预处理后，移植入椎管鞘内治疗SCII[4]。因此本文拟就低氧预处理促进BMSCs功能并减轻SCII作用的相关机制进行综述。

1 BMSCs的临床治疗应用

BMSCs由Becker AJ等人于1963年首次报道[5]，这类细胞可以在体外培养、表达特定的表面抗原而且具有多向分化潜能[6]。因为 BMSCs以上的这些特性，临床上将自体BMSCs移植入不同的部位用以治疗相应的疾病，如治疗肝衰竭[7]、慢性缺血性心衰[8]、术后的皮肤缺损[9]等。在治疗脊髓损伤方面，Satio F等[10]最早进行了BMSCs鞘内注射的临床试验，随访期间患者感觉及运动功能有所提高，但尚无法与自身修复所区分。在随后的临床研究中发现，BMSCs移植在治疗慢性期脊髓损伤方面效果不明显[11,12]。然而在治疗SCII方面，目前的研究还处于动物实验阶段[13]。

此前的研究表明，将BMSCs注入SCII的动物模型椎管鞘内，可有效的降低神经功能损伤，减轻脊髓组织病变[14]。其作用机制可能涉及：抑制MMP-9和TNF-a的过度表达、分泌可溶性细胞因子（如IL-10）和神经营养因子、抑制细胞凋亡和形成突触联系等[14-18]。为了进一步增强BMSCs的作用，研究发现在低氧气浓度环境中培养BMSCs后再移植入动物模型椎管鞘内，发现动物神经功能评分较正常氧浓度组明显提高，证实了低氧可以促进 BMSCs发挥作用[13,19]，其可能的机制如下所述。

2 低氧预处理增强BMSCs减轻SCII的机制

2.1 抑制SCII炎症反应

SCII包括急性缺血损伤和延迟再灌注损伤两个过程。在第一个过程中，短时间的缺血往往导致不可逆的神经损伤。而在第二个过程中，再灌注会加重四肢神经功能损伤[20]。在这两个过程中都涉及炎症反应，并且目前研究认为炎症反应是SCII发生的主要原因[3]。当发生SCII时，会有大量的炎症细胞聚集在脊髓的灰质[21]，包括巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞[22]。这些细胞可合成大量细胞因子，如 TNF-、IL-1和 IL-6等[1,23]，促进更多的炎症细胞聚集，加重炎症反应。另外有些细胞因子可以起到减轻炎症反应的作用。NautaAJ等[15]研究发现BMSCs可分泌可溶性细胞因子 (如IL-10)，介导抗炎调节。王丽萍等[24]在大鼠的脊髓缺血再灌注模型中，观察到低氧预处理组，术后24小时内大鼠后肢神经行为学评分和脊髓腰段组织IL-10的含量明显提高，同时出现脊髓腰段前角小角质细胞、星型胶质细胞活化数量和TNF-、IL-1、IL-6含量降低。证明了BMSCs在低氧预处理后对大鼠的SCII有保护作用。有研究发现STAT3是调控IL-10生成的关键转录因子。若阻断了这一信号传导通路，可导致小胶质细胞激活，释放TNF-、IL-l、IL-6、MCP-1、MIP-1等促炎细胞因子，引起炎性级联反应，通过多种途径介导缺血再灌注损伤[25]。如果在低氧预处理BMSCs前分别加入STAT3抑制剂WP1066和IL-10单克隆抗体，会发现BMSCs的保护作用完全消失，证实了低氧预处理可以刺激 BMSCs，随后通过 STAT3／IL-10信号通路抑制炎症反应，从而减轻大鼠的SCII[24]。

2.2 增强BMSCs向损伤组织迁移和粘附的能力

Yin F等[17,26]研究发现将 BMSCs移植入大鼠脊髓后，可以通过促进神经突起生长和再生，抑制自我吞噬和抗凋亡，减轻 SCII。然而无论通过哪种途径，其发挥作用的前提就是向损伤部位的迁移、归巢、定植[27]。故提高BMSCs向损伤组织迁移，并与之粘附的能力，有利于其发挥抗损伤及修复等作用。Zurita M等[28]通过实验发现，将BMSCs移植到脊髓损伤处后，观察到有统计学意义的动物行为学评分提高、神经元以及星形胶质细胞的标志物表达增多，证实了BMSCs的修复作用。BMSCs向脊髓的定向迁移和粘附受粘着斑激酶（FAK）的影响，这一酶是在基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)与其特异性受体 CXC趋化因子受体4(CXCR4)结合时激活的[29-31]。研究大鼠的脊髓缺血再灌注模型发现，低氧预处理能够明显提高术后5天内大鼠BMSCs中SDF-l、CXCR4和 -FAK表达，同时提高其向SDF-l迁移能力、与FN粘附能力和神经行为学评分，并且脊髓组织BMSCs聚集度明显升高。证明BMSCs经低氧预处理可增强其向受损组织迁移，并与其粘附的能力，对大鼠的SCII有保护作用。如果在低氧预处理BMSCs前分别加入CXCR4拮抗剂AMD3100和FAK抑制剂粘着斑相关非激酶，会发现这一保护作用完全消失[32]。

2.3 上调血红素氧合酶-1表达

血红素氧合酶-1(HO-1)是一种诱生型应激蛋白，发生SCII时其表达上调，通过抗氧化、抗炎、抗凋亡等机制，对脊髓起到保护作用[33]。有研究认为，HO-1可以引起HIF-1、SDF-1和VEGF的表达增多，动员周边骨髓组织释放内皮祖细胞(EPCs)，减轻缺血再灌注损伤[34]。低氧预处理BMSCs可以使脊髓组织HO-1mRNA及其蛋白表达上调，升高再灌注后各时点大鼠的神经功能评分，减轻SCII[35]。关于HO-1上调减轻SCII的机制还有待于进一步研究。

2.4 上调低氧诱导因子-1表达

低氧诱导因子-1(HIF-1)本质为一个异源二聚体的转录因子，其由HIF-1和HIF-1两个亚基组成。其活性的控制是通过不同亚基对氨基酸残基的翻译后修饰来实现的，其中起主要作用的是 亚基。Majmundar AJ等[36]研究发现在低氧环境中HIF-1表达量增加。其本身在组织和细胞对缺氧的适应过程中起重要作用，其作用机制主要为对抗低氧环境，促进新生血管的形成，重建微循环，从而减轻脊髓的损伤[37]。另外HIF-la表达的上调，还可以间接增强BMSCs的作用，进一步减轻SCII。刘红等人[38]在大鼠的脊髓缺血再灌注模型中，观察到氯化钴(CoCl2)化学低氧预处理可以增强BMSCs的细胞迁移能力。利用siRNA技术沉默HIF-l基因以及使用CXCR4抑制剂AMD3100处理后，这一作用消失。证明HIF-l是通过介导CXCR4表达增加发挥作用。进一步研究发现低氧预处理可以促进BMSCs体外增殖，减轻细胞坏死，但是对于细胞调亡无明显影响。这一作用的机制可能与低氧预处理后HIF-1表达增加及上调其下游基因GLUT-1和VEGF表达有关低氧预处理对大鼠BMSCs增殖。另外HIF-l可以通过提高BMSCs对缺血缺氧的耐受能力，减轻SCII[39]。

由上述讨论，我们可以发现HIF-1和BMSCs可以各自通过不同的机制，缓解脊髓缺血再灌注带来的损伤。那么利用HIF-1作为目的基因去转染BMSCs治疗SCII则会是新的发展方向，近年来迅速发展。Zhong Q等[40]研究发现将HIF-1转染BMSCs后，出现明显的神经元保护作用，并且改善低氧环境下的神经系统功能。鞘内注射HIF-1-BMSCs细胞悬液可以增高SCII大鼠的BBB评分分布区间。HE染色可见组织细胞形态结构比较完整，神经元细胞未见明显皱缩变形，细胞质内可见尼氏体，远较其他各组损伤轻[41]。樊志刚等[42]尝试用HIF-1基因修饰脐血间充质干细胞，然后将含有此种细胞的悬浮液注入肾下腹主动脉，观察发现基因转染组BBB评分明显升高，脊髓组织HIF-1蛋白表达上调，运动诱发电位潜伏期缩短，波幅增加。由此我们可以看出BMSCs和HIF-1确实可以协同减轻SCII，在一定程度上保护神经元，有利于脊髓神经功能的恢复。并且其保护机制多有交叉，但具体机制仍有待于进一步的研究。可能的机制包括：①受损脊髓组织中丙二醛(MDA)含量降低，超氧化物歧化酶 (SOD)活性升高[43]；②刺激VEGF的分泌，激活下游的Akt/FoxO1信号通路[40]。

3 小结与展望

总之，目前通过大量的动物实验，已证实低氧预处理的确可以促进BMSCs功能并减轻SCII，其可能的机制包括：抑制SCII炎症反应；增强BMSCs向损伤组织迁移和粘附的能力；上调HO-1和HIF-1的表达。然而在低氧预处理促进BMSCs向神经元样细胞和神经胶质细胞分化，进而减轻SCII方面仍存在欠缺，需进一步的探讨。虽然低氧预处理增强BMSCs功能减轻 SCII已经得到动物实验的证实，但通过BMSCs移植法治疗SCII的临床价值还须进一步在临床应用试验中得到确认。

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Protective mechanisms of hypoxia preconditioning on the ability of bone marrow stem cells tolerant spinal cord ischemiareperfusion injury

SunXin,ShenKangping,JinWenjie,etal.DepartmentofOrthopedics,Shanghai NinthPeople’sHospital,Shanghai JiaoTong University School of Medicine,Shanghai,201999,China

Spinalcord ischemia-reperfusioninjury(SCII)is acommon complicationafter spinaldecompressionoperation, and there are various forms of treatment.Among these methods,intrathecal transplantation bone marrow stem cells (BMSCs)isaneffectivemethod.Currently,many researchesprovethathypoxiapreconditioningcan promotetheability of BMSCs to alleviate SCII.The objective of this article is to review the relevant mechanisms of hypoxia preconditioning promoting the ability of BMSCs to reduce SCII.

Spinal cord;Ischemic reperfusion injury;BMSCs;Hypoxia;Preconditioning

R318

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.06.17

swgk2016-05-00103

孙鑫（1991-）男，硕士研究生在读。研究方向：脊柱外科。

*[通信作者]沈康平（1965-）男，博士，硕士生导师，主任医师。研究方向：脊柱外科。

2016-05-17)

上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海200011