IL-17A基因启动子区多态性与川崎病易感性的相关性研究*

钟芳芳,袁霞,周太光,邹艳,刘文君

（四川医科大学附属医院儿一科，四川泸州646000）

IL-17A基因启动子区多态性与川崎病易感性的相关性研究*

钟芳芳,袁霞,周太光,邹艳,刘文君

（四川医科大学附属医院儿一科，四川泸州646000）

目的：研究泸州地区汉族儿童白细胞介素-17A（Interleukin 17A，IL-17A）基因多态性与川崎病易感性及冠脉损伤的关系。方法：应用序列特异性引物聚合酶链反应（sequence specific primers-polymerase chain reaotion,SSP-PCR）法检测110例泸州地区汉族川崎病患儿及125名健康儿童IL-17A基因启动子区域（-197G/A和-692C/T）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP），分析川崎病组与对照组之间以及冠脉损伤组及冠脉未损伤组之间的差异。结果：IL-17A-197G/A位点川崎病组患儿AA基因型频率（29.1%）显著高于对照组（15.2%）（P=0.015），A等位基因携带者罹患川崎病风险是G等位基因携带者的1.392倍（95%CI：1.009-1.865，P=0.041）；而IL-17A-692C/T位点基因型及等位基因频率分布在川崎病组和对照组间无统计学差异（P＞0.05）。IL=17A基因启动子区两个位点的基因型及等位基因频率分布在川崎病冠脉损伤组和冠脉未损伤组无显著差异。结论：IL-17A基因启动子区域-197位多态性与泸州地区汉族儿童中川崎病易感性相关，-197A等位基因携带者更易罹患川崎病，而IL-17A-692C/T位点多态性与该地区儿童川崎病的易感性无显著相关性。

白细胞介素-17;单核苷酸多态性;川崎病;易感性

川崎病（kawasaki disease，KD）是儿童最常见的自身免疫性血管炎综合征，其最严重的威胁是冠状动脉损伤（Coronary artery lesions，CAL），在很多国家和地区其已成为导致儿童获得性心脏病的最常见原因[1]。1967年发现至今，KD病因及发病机制仍不清楚，但已有大量的研究支持该病的病因可能与感染引起的炎症反应及免疫紊乱有关，而宿主的遗传背景差异影响着其对KD的易感性[2]。IL-17（通常指IL-17A）是重要的炎症因子，参与人类各种生理病理变化。目前，已有IL-17A基因启动子区域-197位（rs2275913）SNP与儿童哮喘、-692位（rs8193036）SNP与溃疡性结肠炎等免疫性疾病的易感性相关的报道[3-4]。本研究拟用SSP-PCR法检测IL-17A基因-197位、-692位的基因型，试阐明其基因多态性与川崎病易感性及患儿冠状动脉损伤的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究经泸州医学院附属医院伦理委员会批准，入选患儿经家属知情同意。

病例组：应用随机数字表法选取2013年08月至2014年12月泸州医学院附属医院门诊随访及住院川崎病儿童110例，年龄(2.3±1.1)岁，男∶女1.2∶1。所有病例均符合日本KD诊断标准（2002修订版，http:// www.kawasaki-disease.org/diagnostic/index.html）。其中川崎病合并冠状动脉损伤（KD-CAL+）包括冠状动脉扩张和冠状动脉瘤，其诊断标准参照的是第七版诸福棠实用儿科学[5]。统计110例川崎病患儿，其中合并冠状动脉损伤（KD-CAL+）46例（41.8%），无冠状动脉损伤（KD-CAL-）64例（58.2%）。

健康对照组：应用随机数字表法选取我院门诊健康体检儿童125例，年龄（3.9±2.5）岁，男∶女为1.3∶1。近期未有发热感染病史，并排除肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病病史。

1.2 DNA提取

每例病例组和对照组研究对象均采外周静脉血200 μl（EDTA抗凝）提取人基因组DNA（TianGen Biotech,China）。

1.3 引物设计及合成

根据人基因库中已知的DNA序列及IL-17A（-197G/A和-692C/T）基因SNP设计序列特异性引物（Gene ID:3605）(见表1)。

1.4 SSP-PCR反应及产物电泳分析

PCR反应体系：特异正向引物F1(或F2)和内参正向引物各0.5 μL，通用反向引物1 μL，2 μL DNA，12.5 μL 2×Power Taq Master Mix(BioTeke, China)，用灭菌双蒸馏水将总体积补充至25 μL。PCR反应条件：①IL-17A-197G/A位点：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸40 s，35个循环，72℃延伸5 min。②IL-17A-692C/T位点：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，52℃退火40 s，72℃延伸40 s，35个循环，72℃延伸5 min。在Mycycler热循环仪(Bio-Rad,USA)上完成以上反应。

将5 μL PCR产物加入1.5%琼脂糖凝胶样孔中，在0.5×TAE缓冲液中设置电压110 V室温电泳35 min后于自动凝胶成像仪（Gene Company, UK）上观察判断结果并记录电泳图谱（见图1）。

图1 IL-17A基因SSP-PCR产物电泳图

1.5 PCR产物测序分析

将已初步确定基因型的研究对象的DNA样本两位点各随机选取3份用内参引物（C,R）PCR扩增后，产物送至上海生工生物工程有限公司进行DNA测序分析，以验证SSP-PCR检测SNP的可靠性。

1.6 统计分析方法

Hardy-Weinbergy遗传平衡定律对所有SNP进行遗传平衡检测；直接计数法计算两组人群两位点基因型及等位基因的频率，卡方检验分析组间分布差异，优势比（odds ratio，OR）评估相对危险度并计算95%可信区间(confidence interval,CI)。以上均应用SPSS18.0进行分析，P＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 遗传平衡检验结果

Hardy-Weinbergy遗传平衡定律检验川崎病组和对照组IL-17A-197 G/A，-692 C/T位点的基因型频率，均达到遗传平衡（P＞0.05），说明本研究入选对象有群体代表性。

2.2 PCR产物测序结果分析

将经SSP-PCR检测初步确定基因型的样本用内参扩增，其PCR产物正向测序，所有测序结果与IL-17A基因Genebank正常序列和SSP-PCR的检测结果均一致，表明应用SSP-PCR法检测IL-17A基因SNP是可靠的。

2.3 IL-17A-197G/A、-692C/T位点基因型及等位基因频率分布分析

在川崎病组和对照组间，-197G/A位点基因型和等位基因频率分布有显著差异，川崎病组AA基因型分布频率（29.1%）显著高于对照组（15.2%），P=0.015，OR=2.427，95%CI为1.291-4.153；川崎病组-197 A等位基因分布频率（51.4%）显著高于对照组（41.6%），P=0.041，OR=1.392，95%CI为1.009-1.865。而-692C/T位点基因型及等位基因分布频率无统计学差异（P＞0.05,见表2）。

表2 川崎病组和对照组IL-17A(-692C/T、-197G/A)基因型和等位基因频数分布[例(%)]

2.4 IL-17A基因多态性与KD合并CAL关系的探讨

IL-17A-197位及-692位基因型及等位基因频率在发生冠状动脉损伤和未发生冠状动脉损伤的川崎病患儿中分布无统计学差异（P＞0.05）（见表3）。

表3 IL-17A基因型及等位基因在KD-CAL+和KD-CAL-中的分布[例(%)]

3 讨论

川崎病是一种主要发生于5岁以下婴幼儿全身性血管炎综合征，其发病机制尚未完全阐明，发病率却逐年增高。北京＜5岁儿童发病率由1995年的18/10万升高到2009年的87/10万，已成为我国儿科住院的常见病之一[6]。临床上主要表现为不明原因发热5 d以上，皮肤黏膜损害，双侧非化脓性结膜炎，肢端硬肿，多形性红斑以及颈淋巴结非化脓性肿大。冠脉损伤是KD最大的威胁，急性心力衰竭、冠状动脉瘤破裂等是其主要的死亡原因。医学家和免疫学家对川崎病的病因及发病机制进行了深入的研究，目前普遍认为，感染因素所触发的急性炎症和免疫调节紊乱是KD发生的关键。Th17细胞是由Park HD等[7]和Harrington LE等[8]分别发现的一种能够分泌IL-17的新型CD4+T细胞亚群，在机体防御反应和自身免疫性疾病中具有重要意义。迄今IL-17家族已IL-17A(通常所指的IL-17)、IL-17B、IL-17C、IL-17 D、IL-17 E(亦被称为IL-25)和IL-17F[9]等6位成员，其中研究发现IL-17A、IL-17 E及IL-17 F是重要的致炎症因子。IL-17可以促进多种促炎症因子如IL-6、IL-1β、TNFα等的分泌，而IL-6能够正反馈进一步促进Th17细胞的分化和激活急性期炎症反应[10]。已有研究发现：KD急性期患儿血清及外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)培养上清液中炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNFα等水平显著升高，其中患儿血清IL-6水平较正常儿童高10倍；急性期患儿产生IL-17的Th17细胞与血清中IL-6水平均较正常儿童明显增高，且增高的Th 17细胞和IL-6水平二者呈正相关[11]。

本文通过SSP-PCR检测法研究IL-17 A基因-692位点和-197位点多态性与川崎病易感性及患儿冠脉损伤的关系。结果表明：在泸州地区汉族儿童中IL-17 A基因存在-197 G/A、-692 C/T多态性；其中IL-17 A-197位点的基因型在泸州地区汉族健康儿童中AG型52.8%，GG型32.0%，AA型15.2%，等位基因以G型（58.4%）最多，与本人在研究生阶段检测的重庆地区人群中AG型53.7%，GG型31.3%，AA型15.0%的分布十分接近，而与Nordang GB[12]报道的在新西兰人群中AG型47.0%，GG型41.0%，AA型12.0%的数据资料有一定差异，可能与种族及地区不同有关，也验证了KD的发病存在明显的人种和地域的差异；川崎病组与对照组比较，-197位点AA基因型、A等位基因频率分布有显著性差异（P＜0.05），提示IL-17A-197位等位基因A可能是川崎病的易感基因，A等位基因携带者比G等位基因携带者罹患川崎病的风险高1.392倍。而在本研究中IL-17 A基因-692C/T位点的基因型和等位基因在川崎病组和对照组分布无统计学差异，提示-692 C/T位点基因多态性可能与川崎病的易感性无显著相关性。进一步统计发现，IL-17 A-197位和-692各基因型及等位基因的分布与川崎病冠状动脉损害的发生无显著统计学差异，表明两位点的多态性与川崎病冠脉动脉损害的发生无关。上述的研究发现与本人在研究生期间所做的关于重庆地区汉族儿童IL-17基因多态性与川崎病易感性的关系的研究结果相一致，这与泸州地区和重庆地区同属西南地区，且标本来源同为汉族儿童有关。研究结果也为明确KD发病的相关易感基因生物信息库提供数据，为进一步开发KD防治举措奠定基础。

综上所述，本文研究提示在泸州地区汉族儿童中IL-17 A基因-197位多态性与川崎病易感性相关，IL-17 A-197 AA基因型更易罹患川崎病。而IL-17 A基因-197位多态性是否影响IL-17蛋白的表达及其功能，还需进一步的功能学试验研究。同时，正如前文所提及的基因多态性的分布频率在同地区不同种族、同种族不同地区是有所不同，其与疾病的易感性的关系也可能有差异，故需要在不同地区、不同种族中进行多中心大样本的研究，才能进一步揭示IL-17 A基因多态性与川崎病易感性及患儿冠脉损伤的关系。

1.Nagao Y,Urabe C,Nakamura H,et al.Predicting the characteristics of the aetiological agent for Kawasaki disease from other paediatric infectious diseases in Japan[J].Epidemiol Infect,2015 Jul 23:1-15[Epub ahead of print].

2.Singh S,Vignesh P,Burgner D.The epidemiology of Kawasaki disease:a global update.Arch Dis Child.2015 Jun 25.pii:archdischild-2014-307536. doi:10.1136/ archdischild-2014-307536.[Epub ahead of print]Review.

3.Wang JY,Shyur SD,Wang WH,et al.The polymorphisms of interleukin 17A(IL17A)gene and its association with pediatric asthma in Taiwanese population[J].Allergy, 2009,64(7):1056-1060.

4.Arisawa T,Tahara T,Shibata T,et al.The influence of polymorphisms of interleukin-17A and interleukin-17F genes on the susceptibility to ulcerative colitis[J].J Clin Immunol,2008,28(1):44-49.

5.胡亚美,江载芳.诸福堂实用儿科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社,2008:700-701.

6.胡亚美,申昆玲,沈颖.诸福堂实用儿科学[M].第8版.北京:人民卫生出版社,2015:778.

7.Park H,Li Z,Yang XO,et a1.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interteukin 17[J].Nat Immunol,2005;6(11):1133-1141.

8.Harrington LE，Hatton RD,Mangan PR,et al.Interleukin 17-producing Cd4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type l and 2 lineages[J]. Nat Immunol,2005,6(11):1123-1132.

9.Gaffen SL.Structure and signalling in the IL-17 receptor family[J].Nat Rev Immunol,2009,9(8):556-67.

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11.沈文婷,蒋利萍,李淑娟,等.川崎病急性期患者Th17细胞检测及意义[J].中国免疫学杂志,2010,26(5):458-461.

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（2015-10-11收稿）

Association analysis between polymorphisms of interleukin 17A gene promoter and susceptibility to kawasaki disease

Zhong Fangfang,Yuan Xia,Zhou Taiguang,Zou Yan,Liu Wenjun
Department of Pediatrics,the Affiliated Hospital of Sichuan Medical University,Luzhou 646000,Sichuan Province,China

Objective：To investigate the association between susceptibility to Kawasaki disease(KD)and polymorphisms of interleukin 17A(IL-17A)gene promoter in children of Han Chinese in Luzhou,Sichuan,China.Methods：Using the sequence specific primers-polymerase chain reaction(SSP-PCR)to detect and compare the differences between single nucleotide polymorphisms of IL-17A promoter(-197G/A,-692C/T)in 110 patients with KD and 125 healthy children as control subjects.Results：The frequency of AA genotype at-197G/A in IL-17A in KD patients(29.1%)was significantly higher than that in controls(15.2%)(P＜0.05),and children with A allele were 1.392 times more likely to suffer from KD than children with G allele(95%confidence interval 1.009～1.865,P＜0.05).However,there were no statistic differences in frequencies of genotype and allele at-692C/T in IL-17A between patients and controls(P＞0.05).Moreover，there were no significant differences in frequencies of genotype and allele between the KD-CAL+and KD-CAL-in IL-17A（-197G/A、-692C/T）(P＞0.05).Conclusion：Polymorphism of IL-17A promoter at position-197 is related to susceptibility of KD in children of Han Chinese,with-197A allele was more vulnerable to KD.There was no significant correlation between SNPs at-692C/T in IL-17A promoter and susceptibility to KD.

Interleukin-17(IL-17);Single nucleotide polymorphism(SNP);Kawasaki disease(KD);Susceptibility

R725.6；R-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.01.009

*四川省泸州市科科技局创新苗子基金（项目编号：2014-R-52（13120））

钟芳芳（1986-），女，医师，硕士，E-mail：597401017@qq.com