简易方法制备复合蛋白酶样品

霍雨霞萨玉龙杨相政

（1.呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古呼伦贝尔021000；2.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）



简易方法制备复合蛋白酶样品

霍雨霞1萨玉龙1杨相政2

（1.呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古呼伦贝尔021000；2.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）

摘要：本实验在几种常见蛋白酶（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶）单酶水解效果比较基础上，按一定比例配制复合酶进行水解，通过测定水解液的水解度、透光度和过滤速度检测水解效果，得出水解效果最优的复合蛋白酶，结果表明该方法操作简单，应用试验效果明显。此方法适合应用研发能力较弱、实验设备简单的中小型酶制剂企业简易制备复合蛋白酶样品，在短时间内给客户提供酶制剂样品。

关键词：复合蛋白酶；应用研发；样品

蛋白酶来源丰富，除从动、植物中提取外，还可由细菌大量发酵生产，已广泛应用于医疗、食品、制革、缫丝等工业，也可作为重要的生化试剂[1,2]。例如木瓜或菠萝蛋白酶用作啤酒稳定剂，能消除由于啤酒冷藏而产生的蛋白质沉淀等。酶解法是一种新兴的动物蛋白生产方法，因酶解法优点较多，很多食品企业已广泛采用。

由于酶的催化具有专一性，使得单酶不符合许多工艺要求，因此复合酶的使用无疑是酶制剂行业的必然趋势[3]。目前我国酶制剂工业主要存在的问题是复合酶制剂的应用开发力度不够[4]，制约了酶制剂企业的市场开拓能力，尤其是中小型酶制剂企业，无法担负高额的试验研发设备和检测设备，危及企业自身的生存和发展。因此，尽快提高复合酶应用技术，努力提高产品结构，是许多中小型酶制剂企业必经之路。

本文以水解猪肉蛋白为例，在单酶水解基础上，采用三种常用蛋白酶配制复合蛋白酶，测定水解液的水解度、透光度、过滤速度等，检测复合酶水解效率，从而快速制备水解猪肉蛋白的复合蛋白酶样品，试验方法简单，应用效果显著，可视为企业根据简单的应用试验效果，在短时间内配制酶制剂样品较好的方法。

1　材料与方法

1.1试验材料

市售新鲜猪肉馅儿，冷藏备用。

1.2主要试剂

磷酸盐缓冲液pH 6.81，硼酸缓冲液pH 9.18；

中性蛋白酶（5.0×104IU/g），南宁庞博生物工程有限公司；

胰蛋白酶，肇东市酶制剂厂；

木瓜蛋白酶（2.0×105IU/g），南宁庞博生物工程有限公司。

1.3主要设备

凯氏定氮仪（KDN-04A），上海荆和分析仪器有限公司；

恒温水浴锅，电子天平，pHS-25数显pH计，上海精密科学仪器有限公司；

WH7410-50B型电动搅拌器，天津市威华仪器设备有限公司；

紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；

TD-4K-6K-10K高速离心机，上海赵迪生物科技有限公司。

1.4测定方法

可溶性蛋白质含量的测定用凯氏定氮法，具体测定方法见参考文献[5]；

透光度：660nm处透光度T，具体方法见参考文献6；

水解度（DH）计算公式如下[7]：

过滤速度测定见参考文献8。

1.5水解工艺流程

1.5.1预处理

室温下，称取新鲜猪肉馅儿50g于250mL烧杯中，加水100mL，搅拌均匀，将烧杯置于水浴锅中，升温至80～90℃，保温10min后，将烧杯置于凉水中降温至40℃，调节料液pH为7.0。

1.5.2水解条件

在处理好的料液中添加酶，添加量为猪肉馅儿质量的0.3％，置于温度50～55℃的恒温水浴锅中水解，搅拌机（150r/min）匀速搅拌，水解3h后，料液加热煮沸10min灭酶，静置冷却，离心（2000r/min）取上清液，测定水解度、透光度和过滤速度。

1.6复合酶配比

试验对比5种复合酶水解效果，其组成配比见表1。

2　结果与分析

2.1单酶与复合酶水解效果的比较

2.1.1单酶与复合酶水解度的比较

以中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶单酶水解猪肉蛋白的水解效果作为对照，配制复合酶I号、II号、III号在相同酶解条件下水解3h，每30min测定猪肉蛋白水解液的水解度和透光度以及每10mL水解液的过滤时间，结果见图1、图2、图3。

表1　三种蛋白酶复合酶配比

图1　单酶与复合蛋白酶水解猪肉蛋白水解度的比较

反应进行60min左右时，单酶和复合酶水解速度相当，当反应进行到90min时，中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶单酶的水解度已经达到60％左右，且随着水解时间的增加，水解度已经没有明显的增加，而90min时，复合蛋白酶I号、II号、III号水解液的水解度分别为78.23％、70.01％、85.49％，尤其是复合蛋白酶III号在反应120min时，水解度为94.22％，与木瓜蛋白酶单酶的水解度相比增加了约35.4％，与复合蛋白酶I号最大水解度相比增加了12.19％，说明复合酶水解效果比单酶水解效果好，且复合酶III号水解效果最好。

2.1.2单酶与复合酶透光度的比较

图2　单酶与复合蛋白酶猪肉蛋白水解液透光度比较

此外，从图2可以看出，酶解反应结束后，复合酶III号水解液的透光度最大，为91.30，因此选用复合酶III号进行下一步的试验。

2.1.3单酶与复合酶过滤速度的比较

图3　单酶与复合蛋白酶猪肉蛋白水解液过滤速度比较

由图3可以看出，过滤速度复合酶III（1）最慢，为58s/10mL，因此其水解效果最好。

2.2不同配比的复合酶III号水解效果测定

将不同配比的复合酶III，在相同酶解条件下对猪肉蛋白进行水解3h，每30min测定猪肉蛋白水解液的水解度、透光度和水解液的过滤速度，结果见图4、图5、图6。

图4　复合酶III号不同配比水解度的比较

图5　复合酶III号不同配比水解液透光度的比较

从图4可得出，复合酶III（1）号水解效果优于其他三种，当反应进行到120min时，水解度已达94.22％。

根据图5、图6可得出，复合酶III（1）号水解进行3h后，水解液的透光度最高，为91.3％，过滤速度为58s/10mL，与其他几种配比水解效果相比较，效果最佳。

图6　复合酶III号不同配比水解液过滤速度的的比较

2.3确定最佳复合蛋白酶制剂样品

按照以上试验结果，得出水解效果最佳复合蛋白酶为复合酶III（1）号，其配方为木瓜蛋白酶:中性蛋白酶:胰蛋白酶=1:1:1，样品建议添加量为0.3％，水解料液pH 7.0，水解温度50～55℃，水解时间为3h。

3　结论

1）本试验所用三种蛋白酶单酶水解效果比均复合酶水解效果差，因此，在具体应用中应重点考虑复合酶制剂水解猪肉蛋白进行下一步试验。

2）根据试验结果得出的水解猪肉蛋白复合酶的优选配比为木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：胰蛋白酶=1:1:1，复合酶的添加量为0.3％，水解料液pH 7.0，水解温度50～55℃，水解3h时，此条件下，水解度最高可达94.22％，水解液透光度为91.3，水解液过滤时间速度为58s/10mL。

参考文献：

[1]唐婧苗,刘章武,吴绍武,等.解动物蛋白（HAP）的制备及其在食品中的应用[J].武汉工业学院学报,2009,28(2):26-28.

[2]周小娟.正确认识酶制剂[J].畜牧与饲料科学,2014,35(7): 33-35.

[3]周舒翔,丁平,葛元,等.纺织用酶制剂复配技术研究与进展[J].中国纤检,2012,11(22):84-88.

[4]第三届全国酶制剂研究开发应用技术研讨会成功召开[J].食品与发酵业,2012,38(8):113.

[5]汤高奇,柳艳霞,杨继.酶法水解动物蛋白工艺研究[J].杨凌职业技术学院学报,2004,3(4):6-7.

[6]赵妍嫣,姜绍通,陈雄.水解猪肉蛋白制备食用香精的工艺研究[J].食品科学,2009,30(12):40-42.

[7]李小华,吴雨思,于新,等.猪肉蛋白酶法水解工艺优化研究[J].甘肃农业大学学报,2009,2(1):143-146.

[8]王芬.酶制剂的安全性及其在面粉改良中的应用[J].现代面粉工业,2014,28(4):21-22.

The Simple Method of Preparing Compound Proteinase Sample

HUO Yu-xia1SA Yu-long1YANG Xiang-zheng2
(1.Hulunbeier Vocational Technical College,Hulunbeier 021000,China;2.Jinan Fruit Research Institute,All China Federation of Supply&Marketing Co-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:Took the hydrolysis of pork for example to prepare the compound proteinase sample,the concrete method was that prepared the compound proteinase according to a certain proportion based on the hydrolysis result of single factor test (papain,neutrase,trypsin),then tested the degree of hydrolysis,the transmittance of light and the filtration of hydrolysate to check the results.Prepared the compound proteinase sample according to the results in a short time and supplied with the clients.The results showed that the method was efficient,easy and quick,suitable for small and medium enterprises with simple equipments and short of development capabilities.

Key words:Compound proteinase;development capabilities;sample

作者简介：霍雨霞（1984—），女，讲师，研究方向为农产品加工及贮藏

基金项目：山东省自然科学基金（ZR2014CQ019）

收稿日期：2015-07-08

中图分类号：TS214

文献标志码：A

文章编号：1008-1038(2016)02-0017-03